導語

非小細胞肺癌（NSCLC）是一種高度侵襲性和異質(zhì)性的疾病，具有不同的組織學亞型和不同的突變特征。單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術的進步使得能夠在不同階段對復雜的NSCLC腫瘤微環(huán)境（TME）進行剖析。然而，這些研究的一個主要限制是每個研究分析的患者樣本數(shù)量有限。此外，由于缺乏基因組數(shù)據(jù)以及長期隨訪數(shù)據(jù)，無法全面分析生物異質(zhì)性及其對治療抵抗和生存結果的潛在貢獻。

中性粒細胞是促腫瘤和抗腫瘤炎癥途徑的重要介質(zhì)，包括中性粒細胞限制淋巴細胞向惡性腫瘤的轉(zhuǎn)運，從而限制程序性細胞死亡1（PD-1）抑制的效力。非小細胞肺癌患者的相關研究已將中性粒細胞與淋巴細胞比率與臨床結果和免疫治療反應聯(lián)系起來。此外，臨床前證據(jù)強烈支持使用中性粒細胞耗竭劑（如CXCR2拮抗劑）作為免疫檢查點抑制劑的佐劑。

研究結果

1.?構建核心大規(guī)模NSCLC單細胞圖譜

我們首先通過匯編來自19項研究和21個數(shù)據(jù)集的scRNA-seq數(shù)據(jù)構建核心NSCLC圖譜。樣本：298名患者的505個樣本（圖1A）。核心圖譜總共包括來自212名NSCLC患者和86名對照個體的轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，包括196個腫瘤樣本和168個非腫瘤對照樣本。在212例NSCLC患者中，156例在組織病理學上被注釋為肺腺癌（LUAD），41例被注釋為肺鱗狀細胞癌（LUSC），15例未另行指定（NSCLC NOS）。NSCLC樣本包括原發(fā)性腫瘤（n = 176）或轉(zhuǎn)移（n = 45）的組織。將NSCLC患者的疾病分期分為早期（UICC I-II期）與晚期（UICC III-IV）疾病。對照樣本中，89份來自肺部腫瘤患者的遠處非惡性組織，其中65份具有患者匹配的腫瘤樣本。此外，10份樣本來自NSCLC患者的非腫瘤影響淋巴結，79份樣本來自沒有明顯肺癌病史的患者。在對照患者中，18例有慢性阻塞性肺?。–OPD）病史。

核心圖譜整合了 898，422 個單細胞，注釋為 12 個粗細胞類型身份和 44 個主要細胞亞型，包括 169，223 個上皮細胞、670，409 個免疫細胞和 58，790 個基質(zhì)和內(nèi)皮細胞。癌細胞分了以下主要集群LUSC（KRT5、KRT6A、KRT17、SOX2、NTRK2、TP63）；LUAD（CD24、MUC1、KRT7、NAPSA、NKX2-1、MSLN）；具有上皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)化（LUAD EMT）跡象的LUAD（VIM、SERPINE1、CDH1、MIF）；具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的LUAD（LUAD NE）（CHGA、SYP、NCAM1、TUBA1A）；與EMT和轉(zhuǎn)移（LUAD MSLN）相關的間皮素（MSLN）高表達的LUAD；以及表達LUAD和LUSC標記物的NSCLC（MUC1、KRT7、KRT6A、SOX2）（圖1B）。將原發(fā)性腫瘤組織中的LUSC和LUAD中的細胞組成與作為參考細胞類型的癌細胞進行比較時，作者發(fā)現(xiàn)LUSC中的中性粒細胞比例顯著較高，而LUAD中巨噬細胞、CD4+T細胞更豐富（圖1F）。與晚期NSCLC腫瘤相比，早期的細胞類型組成分析顯示早期cDC2的豐度更高。為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，對110名NSCLC患者（55名LUAD和55名LUSC）進行了正交驗證，并對中性粒細胞、CD4+T細胞和巨噬細胞進行了免疫組織化學染色。結果證實了這些發(fā)現(xiàn)（圖1G）。

2.?TME的單細胞組成揭示了不同的NSCLC腫瘤免疫表型

使用擴展圖譜根據(jù)TME的浸潤模式對NSCLC患者進行分層。批量校正細胞類型組分的無監(jiān)督聚類顯示了四種不同的腫瘤免疫表型（圖2A）：（1）免疫缺失（ID）腫瘤（沒有顯著的免疫細胞浸潤，但癌細胞組分較高）；（2） 具有B細胞優(yōu)勢的腫瘤亞型（B；B細胞、漿細胞、肥大細胞）；（3） 具有髓系優(yōu)勢的腫瘤亞型（M；巨噬細胞/單核細胞）；和（4）具有T細胞優(yōu)勢的腫瘤亞型（T；CD8+、CD4+、T調(diào)節(jié)細胞）。分析了四種免疫表型中每一種的癌細胞中差異富集的途徑。ID亞型顯示雄激素途徑顯著下調(diào)（圖2B）。應用CytoSig36工具來定義每種免疫表型癌細胞中富集的細胞因子信號特征(圖2C)。ID組中的大多數(shù)細胞因子信號下調(diào)，IL-4顯著升高(圖2C)。髓系亞群中I–III型干擾素信號顯著上調(diào)，表明巨噬細胞/單核細胞在TME中的干擾素信號傳導的重要性(圖2C)。

3.?細胞間通訊的分析揭示了TME中的異質(zhì)細胞串擾

使用CellPhoneDB配體-受體復合物數(shù)據(jù)庫，接下來通過分析前10個差異表達的癌細胞配體（圖3A），評估了兩種主要組織類型LUAD和LUSC中癌細胞對不同免疫細胞的串擾的差異。在LUAD中，我們發(fā)現(xiàn)從癌細胞到中性粒細胞、巨噬細胞/單核細胞、肥大細胞和經(jīng)典樹突狀細胞（cDC）的KDR-VEGFA軸顯著上調(diào)，這可能與該組織類型中癌細胞的免疫抑制信號有關，與遷移和入侵有關。相反，在LUSC癌細胞中，存在前遷移SPP1信號的上調(diào)，該信號先前被報道為在肺癌組織尤其是鱗狀組織中上調(diào)，以及Jagged1（JAG1）的上調(diào)，其誘導NOTCH，從而通過例如中性粒細胞募集促進腫瘤進展并調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境。通過分析差異表達的癌細胞配體，研究了患者免疫亞群T細胞、B細胞、髓細胞和ID中癌細胞與免疫細胞的串擾（圖3B）。雖然在ID亞群中表達下調(diào)，但B、M和較少的T細胞亞群顯示幾種趨化因子（CXCL9/10/11、CCL3/13/18）向T和髓細胞亞群上的同源受體的信號轉(zhuǎn)導上調(diào)，這表明癌細胞分泌的趨化因子梯度有助于免疫浸潤。

4.?TRN在TME中獲得新屬性

TRN分為腫瘤相關中性粒細胞 （TAN） 和正常相鄰相關中性粒細胞 （NAN）。TANs是一種非常異質(zhì)的細胞群體，具有抗腫瘤和促腫瘤特性。使用擴展圖譜表征了NSCLC中TAN和NAN的轉(zhuǎn)錄組特征（圖5A和5B）。與LUAD患者相比，LUSC患者的中性粒細胞更豐富，通過流式細胞術分析（圖5C）也可以看到?？傮wTAN表型的特征在于OLR1（LOX-1）、VEGFA、CD83、ICAM1和CXCR4的高表達以及CXCR1、CXCR2、PTGS2、SELL（CD62L）、CSF3R和FCGR3B（CD16B）的低表達（圖5D）。圖譜提供了中性粒細胞是NSCLC TME中VEGFA表達的主要來源的證據(jù)（圖5E）。主要關注的高度差異表達的TAN標志物是由OLR1基因為氧化低密度脂蛋白（LDL）的主要受體（圖5D）。此外，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）（OLR1的核受體和直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）在TAN中升高（圖5F）。對NSCLC患者組織的流式細胞術分析證實了TAN中LOX-1（OLR1）的表達升高（圖5G）。

5.?TRN的可塑性和非規(guī)范功能性

在所有圖集中性粒細胞（n=19166），分離了四個TAN亞群（TAN-1至TAN-4）和三個NAN亞集（NAN-1至NAN-3）（圖6A）。標記基因選擇揭示了簇之間廣泛的表型異質(zhì)性，并允許識別每個亞簇的標記基因（圖6B）。NAN-1基因包括S100A12、NETosis共因子PADI4以及促血管生成標志物（PROK2、MMP9）。NAN-2簇與NAN-1簇非常相似，但顯示一些NAN-1特異性基因（例如S100A12、PADI4、MMP9）的表達減少。NAN-3顯示干擾素刺激基因（GBP1、GBP5、IFIT2）的強表達（圖6B）。TAN-1顯示IL1RN的高表達，其負調(diào)節(jié)IL-8分泌以控制過度的中性粒細胞炎癥活性，以及有效的NF-κB激活劑RIPK271和CD44，調(diào)節(jié)細胞募集和粘附（圖6B）。TAN-2亞群的特征在于主要（MHC）II類基因HLA-DRA、CD74、HLA-DMB和HLA-DRB1的表達，表明其表型具有免疫原性抗原呈遞特征。CD74和HLA-DRA也在其他TAN簇中表達，盡管表達水平較低（圖6B）。TAN-3亞群的特點是促炎細胞因子（C15orf48、CCL3、CCL4、CSTB）和LGALS3的高表達，這與中性粒細胞活化和遷移有關（圖6B）。最后，TAN-4顯示出核糖體基因（如RPS12、RPL3、RPN2、RPL23）的高表達（圖6B），類似于嚴重COVID-19患者中發(fā)現(xiàn)的中性粒細胞簇。RNA速率分析，表明從NAN-3向NAN-2和NAN-1的轉(zhuǎn)變。NAN-3和NAN-2分別轉(zhuǎn)變?yōu)門AN-2和TAN-1，TAN-1和TAN-2轉(zhuǎn)變?yōu)樗蠺AN亞型（圖6D）。通過分析每個亞群的差異表達的TRN配體，研究了TRN亞群與CD8+T細胞和癌細胞的細胞相互作用，揭示了NAN與TAN的不同信號（圖6F）。在所有TAN亞群中，發(fā)現(xiàn)VEGFA向癌細胞發(fā)出信號，再次強調(diào)了其重要的促血管生成作用，以及SPP1信號，這與免疫抑制TME和促遷移效應相關。

參考文獻：

Zilionis R, Engblom C, Pfirschke C, Savova V, Zemmour D, Saatcioglu HD, Krishnan I, Maroni G, Meyerovitz CV, Kerwin CM, Choi S, Richards WG, De Rienzo A, Tenen DG, Bueno R, Levantini E, Pittet MJ, Klein AM. Single-Cell Transcriptomics of Human and Mouse Lung Cancers Reveals Conserved Myeloid Populations across Individuals and Species. Immunity. 2019 May 21;50(5):1317-1334.e10. doi: 10.1016/j.immuni.2019.03.009. Epub 2019 Apr 9. PMID: 30979687; PMCID: PMC6620049.