常用的熒光探針：市場上不同的探針，要確定給定實驗的最佳 DNA 染料可能有點(diǎn)困難。 為了簡化這個過程，以下是我們認(rèn)為的 10 種最佳 DNA 染料。

溴化乙錠 (EtBr)
特點(diǎn)：
※ 便宜
※ 簡單
※ 成熟的產(chǎn)品
※ 橙色熒光
溴化乙錠 (EtBr) 是最流行的 DNA 染料之一。這是因為它是最早商業(yè)化的產(chǎn)品之一。早在1950年代，它就被用來治療牲畜的疾病。 1970 年代，科學(xué)家開始將其用作 DNA 探針。除了早期采用之外，溴化乙錠相對便宜。即使是大批量，它仍然非常實惠，每克大約 30 美元，但根據(jù)供應(yīng)商和包裝尺寸，價格可能會大大提高或降低。溴化乙錠非常適合瓊脂糖凝膠電泳中的 DNA 染色。它還可用于檢測 PCR 中的 dsDNA。與 DNA 結(jié)合后，EtBr 的亮度增加了大約 20 倍。當(dāng)被紫外光（~300 nm）激發(fā)時，它會釋放橙色熒光（605 nm）。溴化乙錠還可以根據(jù) RNA 折疊發(fā)生的程度檢測 RNA。然而，溴化乙錠并不是檢測活細(xì)胞中 DNA 的良好探針。這是因為它不能滲透完整的細(xì)胞膜。多年來，溴化乙錠的使用引起了健康問題。特別是，由于溴化乙錠是一種嵌入劑，人們對溴化乙錠作為誘變劑的作用提出了擔(dān)憂。這引發(fā)了關(guān)于溴化乙錠是否最適合常規(guī)實驗室使用的激烈爭論。但截至目前，還沒有研究支持這一說法。當(dāng)大量暴露時，溴化乙錠可能會干擾人類的 DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。在低濃度時，它不被視為危險廢物。

碘化丙啶（PI）

碘化丙啶是一種 DNA 染料和嵌入劑。它與溴化乙錠屬于同一化學(xué)家族。與溴化乙錠一樣，碘化丙錠具有形成其核心的含氮環(huán)結(jié)構(gòu)。它的不同之處在于它具有額外的季胺，該季胺與碘離子離子結(jié)合。與 DNA 結(jié)合后，碘化丙啶的熒光會增加 20-30 倍。如果發(fā)生折疊，它也可以與 RNA 結(jié)合。碘化丙啶是不透膜的。它只能進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞。這使其成為識別死細(xì)胞的絕佳探針。它還可用于定量評估生物樣本中的 DNA 含量。碘化丙啶沒有序列偏好，大約每 4-5 個堿基對結(jié)合一次。它可以被氙燈或汞燈以及 488 nm 氬離子激光器激發(fā)。由于其發(fā)射波長為 617 nm，因此可以輕松用于多重分析?？膳c熒光素等綠色熒光探針結(jié)合使用。它也可以用作多色分析的復(fù)染劑。在價格方面，它明顯比溴化乙錠貴（每克約 1000 美元）。然而，它是流式細(xì)胞術(shù)中非常常見的染料。也可用于熒光顯微術(shù)和熒光光譜學(xué)。

結(jié)晶紫Crystal Violet?

結(jié)晶紫是一種簡單的化合物，由連接到三個胺的三個鍵合苯環(huán)組成。它長期以來一直用于各種醫(yī)療目的，既可用作抗菌劑，也可用作局部防腐劑。它作為組織學(xué)染色劑的使用歷史也很悠久，早期的使用可以追溯到 1800 年代后期。結(jié)晶紫可能最為人所知的是它在革蘭氏染色中的用途，以確定細(xì)菌是革蘭氏陽性還是革蘭氏陰性。作為DNA染料，結(jié)晶紫可用于凝膠電泳中的核酸檢測。在這些應(yīng)用中，它可以替代溴化乙錠等熒光染色試劑。這是一個特別強(qiáng)大的優(yōu)勢，因為使用紫外光源激發(fā)熒光探針可能會導(dǎo)致 DNA 降解。然而，結(jié)晶紫的這種應(yīng)用的代價是靈敏度的損失。在實驗中，結(jié)晶紫對 DNA 的敏感性低于溴化乙錠等熒光探針。溴化乙錠可以檢測凝膠條帶中低至 1 ng 的 DNA，而結(jié)晶紫的靈敏度約為 16 ng。如果使用復(fù)染劑（例如甲基橙），這種靈敏度可以提高到 8 ng。但是，它仍然不如溴化乙錠敏感。在定價方面，結(jié)晶紫非常實惠。它也相當(dāng)無毒。如果健康問題是一個問題，結(jié)晶紫可以作為一些更危險的化合物（如溴化乙錠）的無毒替代品。

dUTP 偶聯(lián)探針

※ 聚合酶鏈反應(yīng)
dUTP 共軛探針形成了一類有趣的 DNA 檢測器，主要是由于它們提供的實驗靈活性。 基本思想是使用所謂的鏈接器將探針附加到 dUTP。 然后，通過分子技術(shù)將 dUTP 整合到 DNA 中。 這也將探針結(jié)合到 DNA 大分子中。 通過這種方式，DNA 被探針標(biāo)記。 因為 dUTP 可以與許多不同的探針偶聯(lián)，所以 dUTP 偶聯(lián)物具有廣泛的潛在應(yīng)用。 例如，dUTP 探針可用于監(jiān)測 PCR 反應(yīng)。 它們也可以用作 FISH 程序中的探針。 一般來說，dUTP 探針在發(fā)生 DNA 雜交的情況下表現(xiàn)出色。 一些最常見的 dUTP 偶聯(lián)物包括用地高辛 (DIG)、生物素和熒光素等化合物進(jìn)行標(biāo)記。 用這些化合物進(jìn)行標(biāo)記都為 DNA 檢測提供了非放射性探針。 特別是這些探針還發(fā)現(xiàn)廣泛用于免疫測定，如 ELISA。

DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）

DAPI像許多染料一樣，DAPI 最初是作為藥物合成的。它最初用于治療錐蟲病，一種由寄生蟲引起的疾病。在 1970 年代后期，由于 DAPI 在結(jié)合 DNA 方面的功效以及隨后的熒光大幅增加，DAPI 被用作 DNA 探針。 DAPI 與雙鏈 DNA 的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合得特別強(qiáng)烈，并且在結(jié)合時會經(jīng)歷大約 20 倍的熒光增加。它也可以與 RNA 結(jié)合，但熒光增強(qiáng)較弱且發(fā)射紅移。 DAPI 常用于熒光顯微術(shù)。它在染色死細(xì)胞或膜受損細(xì)胞方面特別成功。 DAPI 可以通過完整的細(xì)胞膜，盡管很困難。因此，不建議用于活細(xì)胞染色。 DAPI 的激發(fā)波長為 358 nm，發(fā)射波長為 461 nm。這意味著當(dāng)使用藍(lán)色/青色濾鏡進(jìn)行可視化時，它將顯示為藍(lán)色。它也可以與綠色熒光探針如 GFP 結(jié)合使用。在實驗中，DAPI 具有很高的細(xì)胞毒性，這強(qiáng)化了避免使用 DAPI 進(jìn)行活細(xì)胞染色的原因。如果發(fā)生接觸，DAPI 對人類是相當(dāng)無毒的。然而，與許多 DNA 探針一樣，DAPI 可能具有一些誘變特性。

7-AAD（7-氨基放線菌素 D）

7-AAD 是一種熒光探針和嵌入劑。 與 DAPI 一樣，它對結(jié)合雙鏈 DNA 具有很強(qiáng)的親和力。 與與富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合的 DAPI 不同，7-AAD 選擇性地與富含 G-C 的區(qū)域結(jié)合。 它還會與 RNA 結(jié)合，因此在染色前可能需要消化酶。 7-AAD 的激發(fā)波長為 546 nm，發(fā)射波長為 647 nm。 由于其較大的斯托克斯位移，許多研究人員將 7-AAD 與藍(lán)色和綠色熒光探針結(jié)合使用進(jìn)行多色分析。 543 nm 氦氖激光器很好地激發(fā)了 7-AAD。 7-AAD 適用于檢測死細(xì)胞群或膜受損的細(xì)胞。 它不容易通過完整的膜，使其成為活細(xì)胞的不良染色劑。 7-AAD 已在熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。

Hoechst 33258 (Hoechst 33342, Hoechst 34580)

※ 藍(lán)色熒光
※ 活細(xì)胞
※ 透膜
※ 低細(xì)胞毒性
※ A-T 序列偏好
※ 氙汞燈
※ 紫外激光
※ 熒光顯微鏡
※ 流式細(xì)胞儀
Hoechst 染料是一組藍(lán)色熒光 DNA 探針。早在 1970 年代，它們就已被用于對 DNA 進(jìn)行染色。這些染料由德國公司 Hoechst AG 開發(fā)，是傳統(tǒng)藍(lán)色熒光染料的良好替代品。與 DAPI 等類似染料相比，Hoechst 染料提供顯著更高的細(xì)胞滲透性。這意味著 Hoechst 染料（例如 Hoechst 33258）適用于對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色。此外，由于 Hoechst 染料的細(xì)胞毒性較低，因此對活細(xì)胞群的影響也大大降低。 Hoechst 染料將選擇性地結(jié)合雙鏈 DNA 的富含 A-T 的區(qū)域，特異性結(jié)合小溝。與 DNA 結(jié)合后，Hoechst 染料的熒光強(qiáng)度會增加約 30 倍。 Hoechst 染料可被紫外光（~360 nm）激發(fā)并發(fā)出藍(lán)色熒光（~460 nm）。這些染料與氙汞燈以及紫外激光器兼容。它們非常適用于熒光顯微鏡、免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)。 Hoechst 33258、33342 和 34580 之間的區(qū)別很重要。與 Hoechst 33258 相比，由于添加了親油性乙基，Hoechst 33342 的滲透性明顯更高。對于 Hoechst 34580，與 Hoechst 33258 和 Hoechst 33342 的 461 nm 發(fā)射最大值相比，發(fā)射最大值略微藍(lán)移，位于 437 nm。

YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1

YOYO-1/DiYO-1/TOTO-1/DiTO-1是基于化合物惡唑黃的花青染料系列。然而，盡管名稱如此，這些染料實際上發(fā)出綠色而不是黃色的熒光。例如，YOYO-1（及其化學(xué)等價物 DiYO-1）的最大發(fā)射波長為 509 nm。 TOTO-1（及其化學(xué)等價物 DiTO-1）也是如此；該化合物的最大發(fā)射波長為 535 nm。這些化合物是嵌入劑，這意味著它們將自己插入 DNA 堿基對的平面之間。這個 DNA 探針家族以其對 DNA 的高親和力而聞名。與 DNA 結(jié)合后，這些探針的熒光可以增加一千到三千倍。這種對 DNA 的強(qiáng)烈親和力使它們非常適合需要高靈敏度的實驗。不過，代價是這些探頭相當(dāng)昂貴。一毫升可能要花費(fèi)數(shù)千美元。因為這些探針是細(xì)胞不可滲透的，它們不能穿過完整的細(xì)胞膜。它們非常適合染色固定或死細(xì)胞。在這方面，這些探針通常與流式細(xì)胞儀等平臺一起用于細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性測定。

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