? ? ?大家好，今天要給大家分享的是分子生物學(xué)實驗中常用的一項技術(shù)：蛋白質(zhì)印記實驗（Western blot ）。Western Blot（WB）可以說是做分子實驗的同學(xué)最長用、也是最肝的一個實驗了。WB可以通過分析蛋白著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況相關(guān)信息，廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。相信同學(xué)們在熟練掌握了WB這門技術(shù)后，實驗進度和發(fā)paper的速度都能得到顯著提升（手動狗頭）。下面我將會從WB簡介、WB常用試劑配制、WB實驗步驟及其原理三個方面來進行介紹。

1.Western blot簡介

??????? Western Blot即蛋白質(zhì)印跡法，由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的，在尼爾·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化學(xué)》（Analytical Biochemistry）中首次被稱為Western Blot。Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法?；驹戆ǖ鞍踪|(zhì)電泳、抗原抗體特異性反應(yīng)及辣根過氧化物酶（HRP）催化顯色等。Western Blot可以通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

????????Western Blot主要步驟包括蛋白提取-電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-顯影曝光等步驟，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。

2.WB試劑配制

2.1 TBST（10X 緩沖液 1L）：Tris base，24 g；NaCl，88 g

2.2 Running buffer（10X 0.5L）：Tris base，15.1g；甘氨酸93.75g；SDS，5g

2.3 Trans buffer（1X 1L）：Glycine 2.90 g，Tris 5.80 g，SDS 1g，甲醇 200，ddH2O定容至1 L.（注：小批量的WB實驗也可直接用Running buffer配制）

相關(guān)試劑配方鏈接：

https://wenku.baidu.com/view/f410b54be518964bcf847cfc.html?_wkts_=1676012791897

2.4封閉液及抗體稀釋液：5% BSA或者牛奶（注：磷酸化蛋白不能用牛奶封閉，奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的條帶變淺）

3.Western blot實驗步驟及相關(guān)原理：

3.1蛋白樣品制備：分為細胞和組織（提取原理相似：主要為通過各種手段將組織/細胞破碎，使蛋白質(zhì)釋放，然后通過高速離心，去除組織/細胞碎片，下面以細胞為例進行講解）

3.1.1裂解液準備：RIPA裂解液+PMSF（蛋白酶抑制劑）= 100：1

3.1.2裂解細胞，細胞刮刮取細胞（注：加裂解液裂解蛋白前，需將PBS洗干凈，否則會稀釋蛋白濃度）

3.1.3離心，取上清液（蛋白質(zhì)在上清中）

3.1.4蛋白質(zhì)定量：蛋白質(zhì)定量有雙縮脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。這里主要介紹BCA法。原理：蛋白質(zhì)可在堿性環(huán)境下將2價銅離子還原為1價銅離子，而1價銅離子可以與BCA試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，2分子的BCA螯合后可形成紫色的復(fù)合物，這種復(fù)合物具有非常好的吸光性(用OD值反應(yīng))。在562nm的紫外光下，溶液中復(fù)合物的OD值與蛋白濃度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。我們可以通過這種線性關(guān)系大致地計算出自己的樣品中總蛋白濃度。步驟依據(jù)各個廠商的試劑盒說明書進行。

3.1.5蛋白變性：加入5X或者1X的蛋白上樣緩沖液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分變性，解除二級或三級結(jié)構(gòu)，只保留一級鏈式結(jié)構(gòu)。上樣緩沖液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的負電荷，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異；DTT還原劑，可打開巰基維持單鏈的線性結(jié)構(gòu)；甘油，可起沉降作用使得混合的樣本沉降到加樣孔底部，不會逸散至加樣孔以外；溴酚藍為小分子藍色物質(zhì)，有指示作用。

3.2 SDS-PAGE凝膠電泳:

3.2.1 SDS-PAGE凝膠制備：可以依據(jù)所需要顯影蛋白分子量的大小選定不同濃度的濃縮膠。

原理：聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。在SDS-PAGE凝膠電泳中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，電泳的速度與蛋白質(zhì)的分子量大小、結(jié)構(gòu)及其電荷量有關(guān)，據(jù)此可以將蛋白質(zhì)分離開。

凝膠主要成分及其作用：

30%聚丙烯酰胺+Tris-HCL：凝膠主要結(jié)構(gòu)。

過硫酸銨（APS）+N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）（注：神經(jīng)毒性）：促凝劑

十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子表面活性劑和強還原劑，可以斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。并且可以使蛋白帶負電，統(tǒng)一蛋白電性。

不同濃度濃縮膠的配方鏈接：http://www.eiaab.cn/article/show/id/21724.html

3.2.2?電泳：恒壓電泳，通常設(shè)置參數(shù)為——濃縮膠：80V/30min；分離膠120V/1.5h（注：利用低壓先將蛋白壓縮到同一平面，高壓將蛋白依據(jù)不同分子量分離開來）。

3.3電轉(zhuǎn)印

??轉(zhuǎn)膜分為半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)兩種類型，其原理均為將凝膠中的蛋白通過電流轉(zhuǎn)移到固相支持物上（注：恒流）。常用的固相支持物包括NC膜和PVDF膜，這兩種膜表面都有肉眼不可見的小孔，都可以用來電轉(zhuǎn)印。NC膜全稱硝酸纖維素膜，帶負電荷的蛋白質(zhì)可以與膜發(fā)生疏水作用而結(jié)合到一起，價格便宜，韌性差易碎，但易于封閉非特異性結(jié)合；PVDF膜全稱聚偏二氟乙烯膜（注：使用前需用無水甲醇活化，活化膜表面的正電基團，使之跟易與負電蛋白結(jié)合），易于吸附蛋白質(zhì)，價格貴，韌性強，適合小分子量蛋白電轉(zhuǎn)印。

3.4封閉

??封閉常采用5%的脫脂奶粉或胎牛血清，室溫下，搖床孵育膜1-2h。（注：磷酸化蛋白必須使用胎牛血清封閉，因為奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的條帶變淺，甚至消失，同時也可能出現(xiàn)較高背景）。

??封閉原理：電轉(zhuǎn)后蛋白質(zhì)已遷移至膜的表面，此時膜上還存在大量的、未吸附蛋白質(zhì)的小孔。此時我們采用牛奶或胎牛血清封閉，其中包含大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)會吸附在那些小孔上，堵住這些孔。如果沒有封閉，那么在下一步我們添加的一抗將同時吸附在目標(biāo)蛋白和膜表面其它位置，且很難洗掉，最終ECL發(fā)光檢測時可出現(xiàn)非特異性條帶、雜帶、高背景等等，浪費抗體不說，還會影響最終的判斷。當(dāng)然，這些奶粉中的蛋白也會一定程度地吸附到目標(biāo)蛋白表面，但是抗原-抗體特異性反應(yīng)相比，這種非特異性的結(jié)合會很輕松的在后面漂洗步驟中消除。

3.5 抗原-抗體免疫反應(yīng)

??這一步是包括一抗與目的蛋白的免疫反應(yīng)及二抗與一抗的免疫反應(yīng)，其原理類似于雙抗體夾心ELISA分析。

首先利用一抗撲獲特異性的抗原蛋白（目的蛋白），然后利用二抗撲獲種屬特異性的一抗。并二抗上通常用辣根過氧化物酶標(biāo)記（HRP），可以催化發(fā)光液上的魯米諾（lumino）底物顯色，從而可以檢測到目的蛋白。

??首先是一抗與目的蛋白表面的抗原表位結(jié)合。比較重要的是一抗孵育溫度和時間，最常用的條件是4℃搖床過夜孵育，溫度適宜，分子運動溫和。有人也用37℃孵育1-2h，可能會成功，但是溫度越高，分子間的運動越激烈，那么出現(xiàn)非特異性雜帶的可能性就越高；同時孵育時間較短，也可能會導(dǎo)致一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合不充分。

??一抗結(jié)合之后，就是采用的二抗與一抗結(jié)合，而二抗蛋白結(jié)通常用HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記，可與發(fā)光底物相結(jié)合，該底物極強的信號輸出能夠使皮克量的蛋白得到檢測。

??就筆者個人經(jīng)驗而言，一抗孵育這一步即是WB中最重要的一步，又是最不重要的一步。特異性高的一抗，WB用腳跑都能跑出來；特異性差的抗體，WB發(fā)明人都不一定做得出來。建議不要省錢買國產(chǎn)抗體，你懂得。買抗體之前，看看近年發(fā)的高分文章，查查他們用的什么哪個公司抗體。如果找不到參考，一定要買經(jīng)過該抗體公司敲除驗證過的抗體。

3.6 辣根過氧化物酶（HRP）蛋白檢測

? 蛋白顯影目前較多采用的是ECL化學(xué)發(fā)光法，ECL工作液包括A液和B液：魯米諾和過氧化物，二者避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用(1：1配制)，目標(biāo)條帶將在黑暗環(huán)境下發(fā)出熒光，熒光會進一步膠片上曝光，熒光越強則膠片上曝光的條帶越黑，最后洗出膠片即可。

??顯影原理：ECL試劑檢測的核心原理為氧化反應(yīng)發(fā)光：魯米諾(lumino)作為發(fā)光底物的主要成分，在堿性條件下，通過辣根過氧化酶(HRP)催化，被H2O2氧化生成3-氨基鄰苯二酸的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時發(fā)出光子，最大發(fā)射波長為425 nm。光子信號可通過X射線膠片或CCD成像儀被捕獲。

本文作者：LGN

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???????本文主要分享了一些有關(guān)蛋白質(zhì)印記（Western blot）技術(shù)的相關(guān)知識。作者能力有限，一些更深層次的內(nèi)容歡迎大家在討論區(qū)補充，也歡迎有相關(guān)研究方向的學(xué)者一起討論交流，謝謝大家！

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