初學(xué)者注意！miRNA才是科研套路之濟(jì)世良方
長(zhǎng)久以來，我一直想寫一篇關(guān)于miRNA的文章。在一年半前，我也與大部分醫(yī)學(xué)科研工作者一樣，在多個(gè)學(xué)術(shù)場(chǎng)合聽到大咖小咖對(duì)于miRNA已經(jīng)過時(shí)的論述，聽得多了，內(nèi)心深處難免產(chǎn)生微妙的抵觸情緒。
而在我回到解螺旋開始系統(tǒng)梳理醫(yī)學(xué)科研的整體方法論之后，經(jīng)過多維度研究比較，我驀然發(fā)現(xiàn)，其實(shí)miRNA才是當(dāng)之無愧的新手之友、從SCI灌水到跨越五分檔次拿國(guó)自然基金無往而不利的科研利器。
今天，我就來談一談選擇miRNA作為研究分子類型的戰(zhàn)術(shù)理由：
1、單個(gè)變量代入五恒量，構(gòu)成了最簡(jiǎn)單的疾病、表型加上分子的三要素課題。變量的分子類型很多，蛋白是經(jīng)典，非編碼RNA是當(dāng)紅趨勢(shì)。非編碼RNA中l(wèi)ncRNA、circRNA更有吸睛效應(yīng)，為何miRNA還有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)？
1） miRNA是非編碼RNA，在做“表達(dá)差異”的環(huán)節(jié)不需要進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，不用買抗體做Western，僅qPCR檢測(cè)RNA水平即可，簡(jiǎn)化了工作量。
2） 在執(zhí)行“一正一反”的Gain / Loss of function過程中，miRNA的過表達(dá)和沉默都只需要訂購(gòu)短片段合成RNA，價(jià)格低廉且到貨周期快。同時(shí)對(duì)于大部分細(xì)胞而言，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可實(shí)現(xiàn)高效導(dǎo)入miRNA mimics或inhibitor到靶細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，易于重復(fù)。
由此可見，在低分灌水階段（單變量研究，不做機(jī)制），miRNA的成文效率比做蛋白和lncRNA / circRNA高。
2、進(jìn)入到二元變量組合，其中最基本的套路是用通路解釋機(jī)制，分子+通路的間接調(diào)控機(jī)制是最基本的四要素課題（疾病、表型、分子、機(jī)制）。
間接調(diào)控關(guān)系的口訣是“你動(dòng)我也動(dòng)”，即過表達(dá)或者沉默主變量，看下游因變量的隨之變化。當(dāng)你進(jìn)行下游探索的時(shí)候，任何分子類型都執(zhí)行一樣的流程，但是因?yàn)閙iRNA過表達(dá)和沉默方便，miRNA的研究依然有一定便利之處。
3、二元變量更好的模式是建立直接調(diào)控關(guān)系，也就是“知其然知其所以然”——有明確的作用靶點(diǎn)和調(diào)控細(xì)節(jié)。在所有的直接調(diào)控模式中，miRNA作用于靶基因的3’-UTR引起下游靶基因表達(dá)沉默是所有直接作用機(jī)制中最簡(jiǎn)單的套路，沒有之一。在實(shí)驗(yàn)的操作性、論證的簡(jiǎn)約度上，設(shè)計(jì)miRNA二元直接機(jī)制優(yōu)勢(shì)非常顯著：
1） 絕大部分直接機(jī)制的研究，都需要至少2個(gè)關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)相互佐證，比如轉(zhuǎn)錄因子研究有ChIP，EMSA和Luciferase Assay，蛋白-蛋白相互作用有co-IP和Pulldown實(shí)驗(yàn)等。
而miRNA結(jié)合靶基因的驗(yàn)證只有一個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)——熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（Luciferase Assay），這個(gè)實(shí)驗(yàn)本身就是直接作用機(jī)制研究里最容易開展的實(shí)驗(yàn)，也沒有之一，就是最容易做的。
2） 在明確主變量、尋找相互作用的靶基因過程中，都需要走數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)或者實(shí)驗(yàn)篩選的流程，RNA和蛋白相互作用或者蛋白與蛋白相互作用預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度不能說特別高，所以很多研究者會(huì)直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選，放棄預(yù)測(cè)環(huán)節(jié)。
而miRNA的靶基因預(yù)測(cè)可以說是其中準(zhǔn)確率最高的作用形式，只需要在幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入miRNA名稱，即可輸出預(yù)測(cè)靶基因結(jié)果，將多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果取交集，再結(jié)合細(xì)胞株中過表達(dá)miRNA之后，這些靶基因是否具有下調(diào)趨勢(shì)的結(jié)果，即可鎖定一組直接作用分子，Luciferase Assay驗(yàn)證成功，即大功告成。
3） 在機(jī)制的Rescue驗(yàn)證環(huán)節(jié)，miRNA模式單一。經(jīng)典作用是負(fù)調(diào)節(jié)下游靶基因，所以口訣是“反正正，反反反”，即上下游同時(shí)過表達(dá)或者沉默。
考慮到miRNA無論過表達(dá)還是沉默都是合成短片段，所以可以根據(jù)下游基因的操作便利度選擇上游的策略。如果下游基因已經(jīng)有過表達(dá)克隆，可以用反正正手段，如果下游基因沒有現(xiàn)成的表達(dá)工具，就去合成siRNA進(jìn)行沉默，用反反反同樣可以快速拿到結(jié)果。
4、超越了二元變量直接調(diào)控，還有更深入的機(jī)制模式，比如三元變量結(jié)構(gòu)——miRNA上游再提出調(diào)控分子，解答驅(qū)動(dòng)因素的問題。miRNA的轉(zhuǎn)錄同樣需要轉(zhuǎn)錄因子，通過常見的轉(zhuǎn)錄因子機(jī)制模式我們可以建立更加復(fù)雜的信號(hào)軸關(guān)系。miRNA的啟動(dòng)子也能被甲基化調(diào)控，轉(zhuǎn)錄出來后也受到剪切過程的調(diào)節(jié)，能夠講的故事不比其他分子類型遜色多少。
5、除了三元變量套路把機(jī)制推向更復(fù)雜的邏輯鏈條，還有一條路也適合miRNA往高分雜志走，那就是外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。外泌體+miRNA的組合是給miRNA帶來全新活力的研究套路，進(jìn)入到多細(xì)胞交互的科研境界，已經(jīng)站在了五分以上的起點(diǎn)上，征服國(guó)自然基金已不在話下。這種高階套路，我們?cè)谔茁氛n的第3期就進(jìn)行深入講解，上半學(xué)年可學(xué)到，打好基礎(chǔ)，不要落下學(xué)習(xí)進(jìn)度。
我是酸菜，我為miRNA代言！miRNA研究有2個(gè)難點(diǎn)，一個(gè)是Luciferase Assay，靠你們自己突破，另一個(gè)是如何預(yù)測(cè)miRNA靶基因或者已知基因反向推測(cè)調(diào)控的miRNA，需要用到一些數(shù)據(jù)庫(kù)，這些數(shù)據(jù)庫(kù)雖然操作簡(jiǎn)單，但總有學(xué)員感覺難以突破。
學(xué)員的需求就是老師的價(jià)值，現(xiàn)在miRNA靶基因預(yù)測(cè)出了【單元課】，從此世間不再有難做的miRNA靶基因機(jī)制。請(qǐng)各位學(xué)員在課程系統(tǒng)的選修課之單元課部分找到精美的PDF圖文教程。Enjoy~
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