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PCR、qPCR、dPCR、RT-PCR……總算是搞明白了

2023-09-21 11:51 作者:南京福麥斯生物 0人讀過 | 我要投稿

我心目中檢測技術(shù)史上的幾次革命性發(fā)明分別是基于抗原抗體特異性結(jié)合原理的免疫標記技術(shù)，PCR技術(shù)和測序技術(shù)。今天我們來聊聊PCR技術(shù)。

按照PCR技術(shù)的演進，人們習(xí)慣性的將PCR技術(shù)劃分為三代：普通PCR技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)，涉及到大家看得眼花的qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR等等。下面就展開講講！

一、什么是PCR？

PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是一種體外擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR技術(shù)自問世以來，在生物科學(xué)領(lǐng)域、分子診斷領(lǐng)域、親子鑒定、法醫(yī)鑒定以及犯罪調(diào)查等方面發(fā)揮了巨大作用，是迄今為止最為重要的技術(shù)之一。經(jīng)過演化和革新，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了三代：普通PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)。

二、PCR的原理

PCR的基本原理與DNA的體內(nèi)復(fù)制相類似，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火和延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)高溫（95℃左右）加熱一定時間后，使其解離成單鏈，以便它與引物結(jié)合；

②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：將溫度降至55℃左右時，引物與模板DNA單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合；

③引物的延伸：再將溫度調(diào)至72℃左右（DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度），DNA模板和引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，沿著磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。這樣經(jīng)變性、退火和延伸重復(fù)若干個循環(huán)后，就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、PCR的分類

1.普通?PCR

普通PCR即一代PCR，使用普通PCR擴增儀擴增靶基因，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行定性分析。

2.實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

實時熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團，在整個PCR過程中通過收集熒光信號實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴增產(chǎn)物量的變化，最后通過標準曲線和CT值對待測樣品進行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法。

①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中最常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號。因此，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強度也會隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

優(yōu)點：價格相對較低；使用方便；對DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。

缺點：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要通過熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴增；不適合進行多重qPCR檢測。

②熒光探針法（TaqMan技術(shù)）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中最常用的檢測方法。PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針是一個寡核苷酸，5'端標記一個熒光報告基團（Reporter, R），3'端標記一個淬滅基團（Quencher, Q）。當探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，以至于無法檢測到熒光信號；而當PCR擴增時（在延伸階段），探針會被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報告基團和淬滅基團分離，報告基團發(fā)射底的熒光不會再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一條DNA，就形成一個熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號累積的越多，熒光強度越大。

優(yōu)點：檢測特異性強；靈敏度高；適合進行多重qPCR檢測；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時間和原料成本。

缺點：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，本底較高；檢測結(jié)果很難判斷實際的擴增特性。

注：多重PCR，也稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在一個反應(yīng)體系中加入兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的一種新型PCR擴增技術(shù)。

3.數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）

數(shù)字PCR即三代PCR，是對原始PCR的另一種改進，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對定量的精準檢測技術(shù)，基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨立、平行的微反應(yīng)單元（納升級）中，使每個反應(yīng)室中平均只有一個拷貝或者沒有目標DNA分子，然后加入熒光信號進行擴增，從而實現(xiàn)靶標核酸分子的絕對計數(shù)，提高檢測靈敏度和準確度。

4.?逆轉(zhuǎn)錄PCR（?Reverse?T?ranscription - PCR?,?RT - PCR）

逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進行，一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進行；而在兩步法中兩個反應(yīng)是分開依次進行的。

5.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進行定量檢測分析。因為RT-PCR只可以定性，但不能進行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進行。

四、總結(jié)

1.PCR，通常指的是普通PCR，以雙鏈DNA為模板，以dNTP為底物，定性擴增雙鏈DNA。

2.qPCR和Real-time PCR，指的是實時熒光定量PCR，以cDNA為模板，以dNTP為底物，對擴增出的DNA進行定量分析。

3.RT-PCR，指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR，以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以dNTP為底物，進行DNA的擴增，屬于PCR的變種，結(jié)果只能定性，不能定量。

4.RT-qPCR，指的是實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，是qPCR+RT-PCR的組合，將總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再作為模板，以dNTP為底物，進行qPCR的定量分析。

參考文獻

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