前言

大腸桿菌 F18 誘發(fā)的腹瀉是仔豬最常見的腸道炎癥疾病之一，可導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失。然而，大腸桿菌 F18 感染易感性的分子機制尚不清楚。

近日，江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（生豬）技術(shù)體系良種繁育崗位專家、揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院包文斌教授為通訊作者，在國際病原學(xué)權(quán)威期刊 PLoS Pathogens (IF: 6.823) 發(fā)表了題為“Insight into mechanisms of pig lncRNA FUT3-AS1 regulating F18-bacterial diarrhea”的研究論文，首次系統(tǒng)解析了 lncRNA 調(diào)控仔豬細菌性腹瀉抗性的分子機制。

研究結(jié)果

1、豬 FUT3-AS1 是與易感性相關(guān)的宿主調(diào)節(jié)因子

為了研究宿主 lncRNA 在斷奶仔豬 F18 感染中的作用，對中國地方豬品種梅山豬和培育品種蘇太豬 F18 抗性仔豬和敏感仔豬十二指腸組織，分別進行了全轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果顯示，共有 3 個 lncRNA 同時在 2 個豬種的 F18 抗性和敏感仔豬中存在差異表達（圖 A）。其中 FUT3-AS1 (TCONS_00183659) 是位于 FUT3 基因反義鏈的一個 lncRNA（圖 B）。已有研究表明 FUT3 基因與F18 受體的產(chǎn)生有關(guān)，且全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示 FUT3 在 F18 抗性和敏感仔豬中也存在差異表達。

RT-PCR、Northern blot 證實 FUT3-AS1 在 ?F18 抗性和敏感仔豬中存在差異表達（圖 C-D）。

圖1｜豬 FUT3-AS1 是與 ?易感性相關(guān)的宿主調(diào)節(jié)因子

2、下調(diào) FUT3-AS1 可以增強 IPEC-J2 細胞對 ?的抗性

進一步研究顯示， F18 刺激可以引起豬小腸上皮細胞 IPEC-J2 中 FUT3-AS1 的表達顯著上調(diào)（圖 A）。在 IPEC-J2 細胞中敲降 FUT3-AS1，粘附在細胞上的細菌數(shù)量顯著降低（圖 D-H）。這些結(jié)果表明 FUT3-AS1 在調(diào)節(jié) 18 感染中發(fā)揮作用，并且其表達的下調(diào)增強了 IPEC-J2 細胞對 ?18 的抗性。

圖2｜下調(diào) FUT3-AS1 可以增強 IPEC-J2 細胞對 ?的耐藥性

3、細胞核中 FUT3-AS1 的作用機制

RNA-FISH 和核質(zhì)分離實驗顯示 FUT3-AS1 在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布（圖 1 E-F），接下來分別研究它在細胞核和細胞質(zhì)中的作用機制。

qRT-PCR?和 western blot 顯示，F(xiàn)UT3-AS1 敲除后細胞中 FUT3 表達顯著降低（圖 A）。RNA pull-down 鑒定到 19 個與 FUT3-AS1 結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中包含組蛋白 H4。RIP-qPCR 顯示組蛋白 H4 可以特異性結(jié)合 FUT3-AS1（圖 E-F）。ChIP、DNA pull-down 結(jié)果顯示，組蛋白 H4 可以直接結(jié)合到 FUT3 核心啟動子區(qū)域（圖 G-H）。

圖3｜FUT3-AS1 通過影響 FUT3 啟動子組蛋白 H4K15ac 水平調(diào)控 FUT3 轉(zhuǎn)錄

使用組蛋白去乙?；种苿┨幚?IPEC-J2 細胞，可以顯著促進 FUT3 的表達，但并不影響 FUT3-AS1 的表達（圖 I-J）。ChIP-qPCR 顯示，siFUT3-AS1 細胞中 FUT3 核心啟動子區(qū)域中 H4K15ac 乙?；斤@著降低（圖 L）。

Alibaba 和 JASPAR 軟件預(yù)測顯示有多個轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到 FUT3 啟動子區(qū)域。雙熒光素酶報告實驗表明，轉(zhuǎn)錄因子 Sp1 的轉(zhuǎn)錄結(jié)合活性在 siFUT3-AS1 細胞中表現(xiàn)出顯著下降、在組蛋白去乙?；种苿?TSA 處理的細胞中顯著增強（圖 M）。

以上結(jié)果表明，F(xiàn)UT3-AS1 可能通過介導(dǎo) FUT3 核心啟動子上的 H4K16ac 水平和 Sp1 結(jié)合活性來促進 FUT3 的表達。

4、細胞質(zhì)中 FUT3-AS1 的作用機制

Small RNA 測序顯示在 抗性和敏感仔豬中有 32 個 miRNA 存在差異表達（圖 A），并構(gòu)建了 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖 B），其中 miR-212 在 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 中都有結(jié)合位點。

IPEC-J2 細胞中上調(diào) miR-212 可以顯著降低 FUT3 的表達，而下調(diào) miR-212 可以顯著促進 FUT3 的表達（圖 C-D）。siFUT3-AS1 細胞中 miR-212 表達顯著上調(diào)（圖 E）。熒光素酶報告和 Ago2 抗體的 RIP 實驗證實 miR-212 可以直接與 FUT3-AS1 和 FUT3 3’UTR 結(jié)合（圖 G-J）。miR-212 inhibitor 可以顯著增加細胞上粘附的細菌數(shù)量（圖 K-L），但同時敲降 FUT3-AS1 時細菌粘附降低。

以上結(jié)果，F(xiàn)UT3-AS1 可作為 miR-212 的分子海綿，促進 FUT3 的表達以增強F18 的敏感性。

圖4｜FUT3-AS1 作為分子海綿吸附 miR-212 并靶向調(diào)節(jié) FUT3

5、FUT3 是防治細菌性腹瀉的潛在靶點

FUT3 主要在空腸和十二指腸中表達，并且主要表達于敏感仔豬的小腸上皮黏膜細胞中（圖 A-C）。 F18 刺激可以引起 IPEC-J2 細胞中 FUT3 表達（圖 E）。FUT3 過表達的 IPEC-J2 細胞粘附的細菌數(shù)量明顯增加，F(xiàn)UT3 敲除細胞中粘附的細菌數(shù)量顯著減少（圖 I-L）。以上結(jié)果表明 FUT3 在 IPEC-J2 細胞對 F18 侵襲易感性中起著關(guān)鍵作用。

圖5｜FUT3 是防治 ?細菌性腹瀉的潛在靶點

接下來進一步評估 FUT3 在體內(nèi)的作用。Fut3 ?敲除小鼠對 F18 誘導(dǎo)的致死性不敏感，而 Fut3 野生型小鼠的腸道出現(xiàn)明顯的病變。Fut3 野生型小鼠體內(nèi) IL-6 等細胞因子表達水平顯著升高、F18 細菌粘附顯著升高。以上結(jié)果表明，面對 ?F18 侵襲，F(xiàn)ut3 野生型小鼠的腸道更容易發(fā)生病變，推測 FUT3 是斷奶仔豬中抵抗 F18 侵染的潛在靶點。

圖6｜FUT3 是防治細菌性腹瀉的潛在靶點

6、FUT3-AS1 激活 FUT3 介導(dǎo)的鞘糖脂生物合成和 TLR 信號途徑

iTRAQ 蛋白組結(jié)果顯示，F(xiàn)UT3-AS1 敲降的細胞中 388 個蛋白表達發(fā)生改變（圖 A），其中多個差異表達蛋白參與了鞘糖脂生物合成途徑（圖 B），并通過 Western blot 和 qPCR 實驗得以證實。敲除或過表達 FUT3、以及刺激同樣會引起鞘糖脂生物合成途徑蛋白的表達變化（圖 E-H）。綜上所述，這些結(jié)果表明 FUT3-AS1 正向調(diào)控 FUT3 表達，激活糖鞘脂生物合成信號。

圖7｜FUT3-AS1 調(diào)控 FUT3 介導(dǎo)的鞘糖脂生物合成途徑

Co-IP 鑒定到 14 個與 FUT3 結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中包括 LRRFIP2，并通過 CoIP-western blot 證實（下圖 A-C）。并且 LRRFIP2 的表達受到 FUT3 敲除或者過表達的影響（圖 D）。

LRRFIP2 是已經(jīng)報道的 TLR 信號途徑的正調(diào)控因子。qPCR 顯示（圖 E-F），F(xiàn)UT3 敲除可以顯著抑制 TLR4 信號途徑成員表達，反之過表達 FUT3 可以顯著激活 TLR4 信號途徑。FUT3-AS1 敲降也可以顯著抑制 LRRFIP2 的表達。這些結(jié)果表明，F(xiàn)UT3-AS1 可能通過促進 FUT3 表達來激活 LRRFIP2/TLR 信號途徑。

圖 8 | FUT3 與 LRRFIP2 互作以調(diào)控 TLR 信號途徑

研究結(jié)論

本研究以仔豬為動物模型，通過全轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了一種稱為 FUT3-AS1 的反義 lncRNA，并闡明了 lncRNA FUT3-AS1 在 IPEC-J2 細胞中調(diào)節(jié) F18 易感性性的相關(guān)機制：

在細胞核中，F(xiàn)UT3-AS1 通過增加 H4K16ac 修飾水平促進轉(zhuǎn)錄因子 Sp1與 FUT3 核心啟動子的結(jié)合活性，進而上調(diào) FUT3 表達；在細胞質(zhì)中，F(xiàn)UT3-AS1 通過競爭性結(jié)合 miR-212，調(diào)節(jié) FUT3 表達。同時，lncRNA FUT3-AS1 通過激活 FUT3 介導(dǎo)的鞘糖脂生物合成和 TLR 信號途徑，來增強 F18 的敏感性。

本研究將為開發(fā)新的策略來防治仔豬細菌性腹瀉提供理論指導(dǎo)。

揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院青年教師吳正常、博士研究生范海瑞為論文共同第一作者。歐易生物在本研究中承擔(dān)全轉(zhuǎn)錄組測序、small RNA 測序及分析工作。

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