前言

纖維化即用無功能結(jié)締組織替代有功能的組織，是幾乎所有人體器官損傷的最終結(jié)果。疤痕是真皮損傷后的纖維化，是一種優(yōu)先考慮愈合速度的晚期進(jìn)化適應(yīng)。

2022年2月，斯坦福大學(xué)Shamik Mascharak等課題組聯(lián)合在Cell Stem Cell.期刊發(fā)表的題為“Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing”（IF:24.633）的研究成果，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)通過激活Trps1和Wnt信號，破壞YAP機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過成纖維細(xì)胞產(chǎn)生再生修復(fù)，Trps1作為一個關(guān)鍵的調(diào)控基因，對傷口再生是必要的和部分充分的。

研究背景

疤痕缺乏皮膚毛發(fā)或腺體，因此，沒有正常的體溫調(diào)節(jié)或屏障功能。盡管纖維化帶來了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，但由于對再生與纖維化愈合的基本機(jī)制的理解有限，目前依然缺乏針對性的治療方案。

研究思路

研究結(jié)果

1.纖維化和再生傷口的多模式分析

由于損傷修復(fù)包括多個階段，檢測治愈過程中細(xì)胞和分子的動力學(xué)就顯得至關(guān)重要了。分析了七個時間點的小鼠傷口和皮膚：UW（未受傷）皮膚、術(shù)后2天(POD2，炎癥)、POD7(成纖維細(xì)胞增殖)、POD10、POD14(傷口重新上皮化，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM)、POD21和POD30(成纖維細(xì)胞重構(gòu)ECM)。傷后立即在傷床上注射維替泊芬或?qū)φ?磷酸鹽緩沖鹽水[PBS])。

對照創(chuàng)面形成明顯的纖維性疤痕，大體為裸露區(qū)域，有致密、線性排列的ECM纖維，無次級成分；相反，POD30時，經(jīng)維替泊芬處理的傷口再生的毛囊（HF）和腺體水平與UW皮膚相似，且ECM纖維密度更低，方向更隨機(jī)。每只小鼠三分之一的組織用于組織學(xué)研究，其余的按建立的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)策略進(jìn)行細(xì)胞分選，以分離成纖維細(xì)胞(Lin?)和其他細(xì)胞(主要是免疫細(xì)胞;Lin+)。一半細(xì)胞用于蛋白組學(xué)分析，其余的用于scRNA-seq分析；每個樣本都用HTO標(biāo)記，使scRNA-seq分析的細(xì)胞和同一只老鼠的蛋白組學(xué)以及組化樣本相聯(lián)系。

成纖維細(xì)胞在維替泊芬治療的傷口中輕度增加；然而，對照組和維替泊芬創(chuàng)面的細(xì)胞比例大致相似。在主成分分析中，Lin-和Lin+蛋白質(zhì)組樣本在時間點上存在顯著差異，而PBS和維替泊芬樣本之間則無明顯差異。GSEA發(fā)現(xiàn)PBS傷口成纖維細(xì)胞在機(jī)械激活方面富集，維替泊芬樣本的傷口成纖維細(xì)胞在蛋白和代謝過程富集。

使用一種新開發(fā)的圖像處理算法對受傷和UW皮膚的ECM超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了量化，確定了每個樣本中結(jié)締組織切片的294個參數(shù)，并通過t分布隨機(jī)鄰域嵌入進(jìn)行聚類分析。隨著時間的推移，對照創(chuàng)面ECM與UW的ECM顯著區(qū)分，顯示纖維化瘢痕。相反，POD14/30維替泊芬創(chuàng)面與UW皮膚重疊，表明維替泊芬治療后愈合產(chǎn)生UW樣ECM。在這兩種處理中，POD7-14之間的差異最大，這與ECM沉積主要發(fā)生在這段時間相一致。

圖1 | 瘢痕和再生傷口修復(fù)的多模式研究

2.識別修復(fù)的分子軌跡

成纖維細(xì)胞對機(jī)械力高度敏感，是瘢痕形成的主要驅(qū)動因素，因此假設(shè)維替泊芬通過改變成纖維細(xì)胞表型促進(jìn)再生，并將scRNA-seq分析集中在成纖維細(xì)胞上。通過Monocle3來生成細(xì)胞軌跡，選擇一個最優(yōu)簇來最大限度地捕捉PODs之間的變化。由此產(chǎn)生的軌跡有兩個分支，早期(POD2)成纖維細(xì)胞在分支點附近，晚期成纖維細(xì)胞在分支末端。UW皮膚成纖維細(xì)胞幾乎全部位于分支末端，該分支也富含維替波芬傷口成纖維細(xì)胞。因此，可以推測分支末端一個再生修復(fù)軌跡，成纖維細(xì)胞向UW樣狀態(tài)發(fā)展，而分支附近是一個相對的纖維化軌跡。

圖2 | 假時間內(nèi)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組軌跡分析

Seurat聚類識別了6個成纖維細(xì)胞聚類：聚類0和4組成了再生部分；1、2、5構(gòu)成纖維性部分；3主要由UW皮膚成纖維細(xì)胞組成。通過計算感興趣軌跡上基因的相關(guān)性，纖維性部分富含促纖維化標(biāo)志物，如Dpp4、Fap和Gpx3。GSEA中和假定時間正相關(guān)性位于前1%的基因集中于ECM聚集，生長因子、轉(zhuǎn)導(dǎo)和纖維化相關(guān)條目。

圖3 | 成纖維細(xì)胞瘢痕形成和再生過程中的假時間和CytoTRACE分析

和假定時間呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)性的基因包括很多發(fā)展和再生相關(guān)的基因，同時還發(fā)現(xiàn)了幾個參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因，包括Wnt靶點Axin2和Twist1；Wnt興奮劑Rspo1等。GSEA分析與假定時間負(fù)相關(guān)相關(guān)的前1%基因，再生部分富集了骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和Wnt相關(guān)條目。

接下來，使用SCENIC平臺來比較基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的軌跡。Trps1、Gli1和Twist1調(diào)控蛋白在再生部分中被更多激活，進(jìn)一步支持Wnt的激活。使用CellChat分析scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在再生部分中涉及瘢痕成纖維細(xì)胞和非典型Wnt信號的促炎信號增加。

圖4 | 分析成纖維細(xì)胞相互作用

通過RNA速率分析，發(fā)現(xiàn)纖維部分和再生部分的RNA速度方向相反，纖維部分指向增加的PODs，而再生部分指向更早的時間點細(xì)胞。應(yīng)用CytoTRACE，UW皮膚成纖維細(xì)胞分化程度最高，而傷口成纖維細(xì)胞分化程度相對較低。隨著POD的增加，纖維部分成纖維細(xì)胞總體分化程度較低，分化程度增加，而再生細(xì)胞沿軌跡分化程度降低，表明隨著愈合過程的進(jìn)展，發(fā)育潛力增加。

接下來分別分析了組成每個軌跡的簇，并檢查了每個分支上與CytoTRACE評分最相關(guān)的基因。纖維性部分評分隨時間的下降主要是由ECM相關(guān)基因驅(qū)動的，與分化成成熟瘢痕成纖維細(xì)胞一致。

3.傷口纖維化和再生軌跡標(biāo)記的研究

通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與維替泊芬創(chuàng)面相比，PBS中Dpp4+細(xì)胞顯著增加，特別是在真皮深層。與維替波芬抑制機(jī)械誘導(dǎo)一致，YAP在PBS創(chuàng)面中表達(dá)高于維替波芬創(chuàng)面或UW皮膚。Trps1在對照創(chuàng)面中表達(dá)很低，但在維替泊芬創(chuàng)面中卻很高?；谌斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)對數(shù)千個細(xì)胞Trps1核定位的定量分析顯示，在維替泊芬創(chuàng)面中，核Trps1+成纖維細(xì)胞數(shù)量較高。盡管如此，UW皮膚Trps1的表達(dá)僅限于基底上皮和真皮乳頭，但在再生HF周圍的維蒂波芬創(chuàng)面中發(fā)現(xiàn)了大量核Trps1+細(xì)胞簇。

PBS和維替泊芬治療傷口的一個顯著區(qū)別是后者在30天內(nèi)出現(xiàn)再生HF，而前者形成裸露區(qū)域。Trps1，在HF發(fā)育中起關(guān)鍵作用，是最重要的候選因子。多項研究表明，Trps1與HF的形態(tài)發(fā)生有關(guān)，而異常的Trps1活性與人類毛發(fā)過度生長的條件有關(guān)，這些研究使Trps1成為一種很有前途的推動傷口HF再生的候選因子。支持這一假設(shè)的是，Trps1+細(xì)胞在再生傷口中富集，并在空間上聚集在新發(fā)性HF周圍。鑒于再生軌跡的特點是機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)減少和Trps1升高，我們推測Trps1可能是傷口再生的關(guān)鍵調(diào)控因子。

基于多模式分析，研究者選擇4個標(biāo)記來區(qū)分和代表纖維化和再生之間的通路：Ankrd1，Trps1，Rspo1和Dpp4。為了探測關(guān)鍵基因的空間分布，研究者上述4種標(biāo)記進(jìn)行了多重RNAscope原位雜交；為了聚焦于真皮成纖維細(xì)胞，進(jìn)行了真皮受限的形態(tài)學(xué)重建。在POD 14維替波芬創(chuàng)面中，在真皮淺表層中發(fā)現(xiàn)含有Rspo1和Trps1 RNA顆粒的成纖維細(xì)胞聚集在內(nèi)陷上皮周圍，與新發(fā)HF一致。

相反，在POD14 PBS創(chuàng)面中，Rspo1+和Trps1+細(xì)胞隨機(jī)分布于真皮。在POD 30，纖維化/再生創(chuàng)面之間表型分化最大的時候，PBS創(chuàng)面成纖維細(xì)胞有更多的Dpp4和Ankrd1，而維蒂泊芬創(chuàng)面有更多的Rspo1和Trps1 RNA顆粒，集中在再生HF周圍。

圖5 | 瘢痕形成和再生過程中成纖維細(xì)胞的空間轉(zhuǎn)錄組分析

4.確定Trps1在再生中的功能意義

為了確定Trps1在傷口再生中的作用，研究者首先進(jìn)行了成纖維細(xì)胞特異性Trps1 OE，以評估在正常瘢痕條件下，Trps1是否足以用于傷口再生。為了證實特異性，非成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的IF染色顯示GFP信號僅存在于成纖維細(xì)胞中，而不在內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞中。

通過在早期(POD3和7)和晚期(POD7和17)中過表達(dá)Trps1，Trps1-OEC創(chuàng)面形成瘢痕，而Trps1-OEE和Trps1-OEL創(chuàng)面瘢痕不明顯，HF再生較少。組織學(xué)證實Trps1表達(dá)增加，并顯示在Trps1-OEE和Trps1-OEL傷口中有少量再生附屬結(jié)構(gòu)和更多的UW樣ECM。這些發(fā)現(xiàn)從定量上證實HF/腺體明顯增加，ECM評分顯著更高。與Trps1-OEE相比，Trps1-OEL傷口的再生更為顯著，這表明Trps1的促再生作用可能在早期愈合時是最顯著的。

為了評估Trps1對維替波芬誘導(dǎo)的傷口再生是否必要，開發(fā)了FLEXon EGFP: miR30-mTrps1慢病毒載體，敲除早期(POD?3/7;Trps1-KDE)和晚期(POD 7/17;Trps1-KDL)的Trps1。對照注射FLEXon EGFP:Scramble miR30慢病毒。POD 30時收集傷口。Trps1-KDC創(chuàng)面表現(xiàn)為毛發(fā)再生和無瘢痕，而Trps1-KDE和Trps1-KDL創(chuàng)面形成無毛疤痕。Trps1-KDE和Trps1-KDL損傷完全破壞ECM再生，取而代之的是疤痕ECM。

有趣的是，僅在Trps1- KDL傷口中觀察到附屬結(jié)構(gòu)的顯著損失，這意味著在愈合后期，為維蒂波芬誘導(dǎo)的附屬再生，Trps1是明確需要的。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，Trps1對于完全的傷口再生是必要的，在早期和晚期愈合中具有獨(dú)特的作用。

圖6?| 成纖維細(xì)胞靶向慢病毒Trps1過表達(dá)和敲除

研究討論

本研究報告了不同的分子事件驅(qū)動皮膚創(chuàng)傷細(xì)胞瘢痕或再生的命運(yùn)。通過單細(xì)胞RNA測序、蛋白質(zhì)組學(xué)和組織水平上對比了疤痕和YAP抑制誘導(dǎo)的傷口再生。整合這些數(shù)據(jù)來揭示纖維化和再生愈合的“分子軌跡”。研究發(fā)現(xiàn)，通過激活Trps1和Wnt信號，破壞YAP的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過成纖維細(xì)胞產(chǎn)生再生修復(fù)。通過在傷口的體內(nèi)基因敲除和過表達(dá)，確定Trps1是一個關(guān)鍵的調(diào)控基因，對傷口再生是必要的和部分充分的。本研究可以作為傷口再生的多組學(xué)圖譜，并可能對病理纖維化有治療意義。

小鹿推薦

本研究利用單細(xì)胞測序技術(shù)、蛋白組學(xué)技術(shù)、組織水平研究發(fā)現(xiàn)了傷口再生過程中的重要調(diào)控基因Trps1，進(jìn)而推動了傷口再生的研究進(jìn)展。目前單細(xì)胞測序技術(shù)已日漸成熟，而其和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用的文章也日漸增多，可以從不同層面推動我們的機(jī)制研究，幫助廣大科研工作者發(fā)表更高水平的論文。

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