VKH（Vogt–Koyanagi–Harada）病是一種急性彌漫性葡萄膜炎，常常伴隨有肉芽腫性全葡萄膜炎、脫發(fā)、白癜風(fēng)、聽力喪失和中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常等病理改變，是導(dǎo)致中青年失明的主要原因之一。流行病學(xué)證據(jù)表明，葡萄膜炎引起的失明率約占發(fā)展中國(guó)家所有眼病的25%。在疾病的進(jìn)展過程中，RPE細(xì)胞作為眾多細(xì)胞因子作用的靶細(xì)胞，其正常工作起到了關(guān)鍵的作用。VKH疾病病因復(fù)雜，普遍認(rèn)為是由遺傳和自身免疫等因素共同作用所致，然而，VKH病的遺傳病因尚不清楚。

2023年10月，北京同仁醫(yī)院侯勝平教授和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院楊培增教授團(tuán)隊(duì)在期刊Cellular & Molecular Immunology (IF 24.1)上發(fā)表了題為“A de novo missense mutation in MPP2 confers an increased risk of Vogt–Koyanagi–Harada disease as shown by trio-based?whole-exome sequencing”的文章。該研究團(tuán)隊(duì)利用TMT標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)結(jié)合全外顯子測(cè)序技術(shù)在VKH病患者中篩選到關(guān)鍵新發(fā)突變 MPP2-K315N (c.G945T, NM_001278372)，發(fā)現(xiàn)其通過直接結(jié)合ANXA2，促進(jìn)ERK3/IL-17E通路激活，從而加劇炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)而破壞屏障功能，最終導(dǎo)致VKH病的發(fā)生發(fā)展，該研究首次在國(guó)際上揭示了VKH病的新生突變MPP2-K315N，這為VKH病的發(fā)生新機(jī)制提供了新的見解，并有助于開發(fā)新的治療靶點(diǎn)。中科新生命為該研究提供了TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

?研究材料

25例VKH患者家系（25例患者及50例正常對(duì)照父母）和2081名VKH患者，6至8周齡雌性小鼠等材料

?技術(shù)路線

步驟1：探究VKH病的遺傳病因；

步驟2：MPP2-N315突變加重EAU炎癥和BRB分解；

步驟3：MPP2-N315突變引起炎癥因子分泌與RPE細(xì)胞屏障功能受損；

步驟4：MPP2-N315突變通過ERK3/IL-17E通路使炎癥加重；

步驟5：ANXA2對(duì)ERK3和IL-17E通路的影響。

?研究結(jié)果

1. 探究VKH病的遺傳病因

為了探究VKH病的遺傳病因，該團(tuán)隊(duì)納入了25例VKH患者家系（25例患者及50例正常對(duì)照父母）進(jìn)行全外顯子測(cè)序，隨后對(duì)2081名VKH患者進(jìn)行了目標(biāo)區(qū)測(cè)序，鑒定出15個(gè)新發(fā)突變，其中膜棕櫚酰化蛋白2 (MPP2) p.K315N (MPP2-N315)突變是最重要的突變之一，且該突變發(fā)生在MPP2的SH3 domain(圖1A)。根據(jù)生物信息學(xué)分析，MPP2-N315突變具有很強(qiáng)的致病性，此外，MPP2-K315N突變?cè)诓煌锓N也具有中高度保守氨基酸，包括人類、恒河猴、小鼠、挪威大鼠、牛、豬、馬、大型飛狐、狗和大熊貓(圖1B)。利用SWISS-MODEL進(jìn)行MPP2-K315N突變的功能性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)?(https:// swissmodel.expasy.org/)，表明賴氨酸(Lys)與絲氨酸(Ser)之間的極性相互作用強(qiáng)于天冬酰胺(Asn)與絲氨酸之間的極性相互作用(圖1C),說明其對(duì)MPP2蛋白的結(jié)構(gòu)或功能有實(shí)質(zhì)性影響。在各種人組織和培養(yǎng)的人細(xì)胞系中均檢測(cè)了MPP2的表達(dá)，其中ARPE19表達(dá)水平最高(圖1D)。研究人員使用人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站還發(fā)現(xiàn)MPP2在T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞和NK細(xì)胞的免疫細(xì)胞中的表達(dá)非常低(圖1E)，scRNA-seq數(shù)據(jù)表明其在RPE細(xì)胞中表達(dá)，但在T細(xì)胞、B細(xì)胞和DC細(xì)胞中幾乎不表達(dá)(圖1F)。

2.?MPP2-N315突變加重EAU炎癥和BRB分解

為了探究MPP2-N315突變的作用機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)用PBS、賦形劑、MPP2-K315或MPP2-N315突變AAV感染小鼠，建立EAU小鼠模型。發(fā)現(xiàn)用MPP2-K315 AAV治療的EAU小鼠的臨床評(píng)分與第14天用PBS或賦形劑治療的小鼠的臨床評(píng)分無顯著差異；相反，用MPP2-N315 AAV治療的EAU小鼠的臨床評(píng)分顯著高于用MPP2-K315 AAV治療的小鼠(圖2A，B)。組織病理學(xué)評(píng)分的比較也顯示了類似的趨勢(shì)(圖2C，D)。此外，血管染色和熒光素眼底血管造影顯示，在接受EAU治療的MPP2-N315 AAV小鼠中，第14天BRB受損，視網(wǎng)膜血管滲漏加劇(圖2E，F(xiàn))。總之這些結(jié)果表明MPP2-K315N點(diǎn)突變或MPP2-K315N腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠病理加重，虹膜粘連以及睫狀充血更加明顯，HE染色顯示大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伊文思藍(lán)及熒光素鈉實(shí)驗(yàn)顯示其視網(wǎng)膜血管滲漏加重。

3.?MPP2-N315突變引起炎癥因子分泌與RPE細(xì)胞屏障功能受損

為了進(jìn)一步研究作用機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)利用MPP2敲除(KO)的ARPE19細(xì)胞過表達(dá)WT或MPP2-N315突變進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示，WT或MPP2-N315突變過表達(dá)達(dá)到了載體水平(圖3A，B)。進(jìn)一步探究了MPP2突變對(duì)細(xì)胞增殖的影響。CCK-8分析表明，在MPP2為KO的ARPE19細(xì)胞中，細(xì)胞增殖顯著降低，可通過MPP2過表達(dá)挽救。含有oeMPP2-N315的MPP2 KO細(xì)胞比含有oeWT的細(xì)胞增殖更快(圖3C)。使用相應(yīng)的ELISA試劑盒測(cè)定了ARPE19細(xì)胞中IL-1β、VEGFA和IL-10的分泌水平。發(fā)現(xiàn)與MPP2 KO ARPE 19細(xì)胞相比，oeWT的MPP2 KO ARPE 19細(xì)胞中這些細(xì)胞因子的表達(dá)水平均升高。此外，MPP2 KO ARPE19細(xì)胞中過表達(dá)的MPP2-N315突變?cè)黾恿薎L-1β和VEGFA的水平(圖3D–F)，表明MPP2-N315突變加重了ARPE19細(xì)胞的炎性反應(yīng)。為了進(jìn)一步確定MPP2-N315突變?cè)贏RPE19細(xì)胞屏障功能中的作用，進(jìn)行了跨上皮電阻(TEER)分析和酚紅浸潤(rùn)試驗(yàn)。結(jié)果表明，與oeWT相比，含有oemp 2-N315的MPP2 KO細(xì)胞的屏障功能受損(圖3G，H)。隨后進(jìn)行了透射電鏡(TEM)分析、免疫熒光和western blotting 進(jìn)一步證實(shí)MPP2-N315突變對(duì)RPE細(xì)胞屏障功能的影響(圖3I-L)?？傊?，這些結(jié)果表明MPP2-N315突變促進(jìn)了RPE細(xì)胞的炎性發(fā)展并破壞了其屏障功能，從而介導(dǎo)了RPE細(xì)胞在VKH病中的關(guān)鍵致病性。

4.?MPP2-N315突變通過ERK3/IL-17E途通路使炎癥加重

為了研究EAU中MPP2突變的潛在機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)在MPP2突變ARPE19細(xì)胞和MPP2突變EAU小鼠中進(jìn)行了TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在ARPE19細(xì)胞中共鑒定出6007個(gè)MPP2-N315突變蛋白，包括33個(gè)上調(diào)蛋白和27個(gè)下調(diào)蛋白(圖4A)。此外，在攜帶EAU的MPP2-N315突變小鼠中，共鑒定出6539個(gè)蛋白，其中34個(gè)顯著上調(diào)，12個(gè)顯著下調(diào)(圖4B)。特別是GO功能分析發(fā)現(xiàn)，MPP2-K315N突變與免疫反應(yīng)和視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)有關(guān)(圖4C，D)。因此，進(jìn)一步研究了幾種經(jīng)典的免疫反應(yīng)相關(guān)途徑，如ERK3、ERK1+2、NF-κB p65和p-STAT3信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與oeWT相比，ERK3在具有oeMPP2-N315突變的MPP2 KO ARPE19細(xì)胞中顯著上調(diào)(圖4E，F(xiàn))。ERK3在用EAU轉(zhuǎn)染的MPP2-N315 AAV小鼠的視網(wǎng)膜中顯著增加(圖4G，I)。此外，帶有EAU的純合或雜合MPP2-N315敲入小鼠顯示ERK3蛋白水平升高(圖4H，J)?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明，MPP2-N315突變通過ERK3/IL-17E途徑加重EAU炎癥。

5.?ANXA2對(duì)ERK3和IL-17E通路的影響

為了確定ANXA2對(duì)ERK3/IL-17E通路的影響，檢測(cè)了ERK3和IL-17E在體外和體內(nèi)的蛋白表達(dá)水平?；贛PP2 KO ARPE19細(xì)胞，與具有scramble的細(xì)胞相比，具有siANXA2的過表達(dá)WT或MPP2-N315突變的細(xì)胞中ERK3減少(圖6A，C)。同樣的，在ANXA2敲除的MPP2- K315或MPP2-N315敲入EAU樣本中，ERK3水平也顯著降低(圖6B，D)。ELISAs顯示，IL-17E分泌在體外和體內(nèi)都顯著減少(圖6E，F(xiàn))?？傊@些結(jié)果表明MPP2-N315突變體可以直接結(jié)合ANXA2蛋白水平的增加，然后促進(jìn)下游信號(hào)通路如ERK3/IL-17E的表達(dá)，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)、視網(wǎng)膜血管滲漏和BRB的破壞(圖6G)。

小結(jié)

研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)VKH病中的一個(gè)新突變MPP2 p.K315N (c.G945T，NM_001278372)，并證明了MPP2-K315N突變?cè)谄咸涯ぱ装l(fā)生和發(fā)展中的有害作用。機(jī)制研究表明，MPP2-N315突變通過直接與更多的ANXA2蛋白結(jié)合，激活ERK3/IL-17E途徑并且會(huì)增加VKH病的風(fēng)險(xiǎn)。該研究首次在國(guó)際上揭示了MPP2-K315N突變可能增加對(duì)VKH疾病的易感性，這為VKH的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解，是該團(tuán)隊(duì)繼在Nat Genet揭示VKH易感基因IL23R、EGR2的又一重要發(fā)現(xiàn)，也是該團(tuán)隊(duì)在葡萄膜炎領(lǐng)域做出的又一重要貢獻(xiàn)。

北京同仁醫(yī)院侯勝平教授和重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院楊培增教授為論文共同通訊作者，劉先洋博士、孟茄玉博士、廖星蕓博士以及劉裕森碩士為論文共同第一作者。本研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、重慶市教委項(xiàng)目等支持。

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