01

前言

Thermal shift assay（TSA），也被稱為差示掃描熒光法（DSF）是表征蛋白熱穩(wěn)定性的常用方法之一，廣泛應(yīng)用于蛋白配體互作表征，突變體、緩沖液、去垢劑篩選等領(lǐng)域。但DSF的實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣，需要根據(jù)蛋白的特性及去垢劑兼容性選擇合適的染料，優(yōu)化蛋白和染料的比例，在配制樣品時(shí)還要考慮染料自帶的有機(jī)溶劑對(duì)蛋白的影響。

替代性技術(shù)：nanoDSF技術(shù)

時(shí)下被行業(yè)深度認(rèn)可的無(wú)標(biāo)記的TSA驗(yàn)證方法-也稱nanoDSF技術(shù)，可解決DSF技術(shù)的局限性，樣品無(wú)需加染料就可以直接上機(jī)檢測(cè)了。下面我們一起通過(guò)用戶的文獻(xiàn)案例來(lái)進(jìn)一步了解。

02

NanoTemper用戶應(yīng)用案例解讀

檢測(cè)樣品：Cas9，gRNA

使用儀器：PR系列蛋白穩(wěn)定性分析儀

涉及技術(shù)：nanoDSF技術(shù)

https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.106399

CRISPER - Cas9介導(dǎo)的基因編輯能夠幫助人們?cè)趧?dòng)物和細(xì)胞模型中實(shí)現(xiàn)廣泛的靶向敲除(KO)或敲入(KI)，例如單點(diǎn)或多點(diǎn)KO、點(diǎn)突變、報(bào)告基因KO或KI等。然而，CRISPR-Cas9的切割效果和準(zhǔn)確性仍是基因編輯面臨的主要挑戰(zhàn)，它們特別受到核糖核蛋白復(fù)合物 (RNP)的組裝配比的影響。

2023年3月，法國(guó)南特大學(xué)的研究人員近期發(fā)表了研究成果：Excess of guide RNA reduces knockin efficiency and drastically increases on-target large deletions，作者借助PR系列蛋白穩(wěn)定性分析儀搭載的nanoDSF技術(shù)，一種無(wú)需標(biāo)記和固定化的方法，證明了Cas9和gRNA的等摩爾比是形成RNP復(fù)合物的最佳條件。

研究結(jié)果

作者通過(guò)CRISPR/Cas9 KI將雙等位純合子GFP hiPSCs轉(zhuǎn)化為BFP表達(dá)細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞表型分析證明在Cas9的最佳濃度為0.4 mM時(shí)，增加ssODN濃度有助于降低KO率，提高KI率，而增加dgRNA對(duì)KO和KI沒(méi)有影響。0.4 mM的Cas9、等摩爾Cas9/gRNA比例和2 mM的ssODN是在hiPSC中實(shí)現(xiàn)高效GFP到BFP轉(zhuǎn)換的最佳選擇。

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在此之前，有一些研究曾表明過(guò)量的gRNA對(duì)于靶向切割有幫助，而本文作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則與之產(chǎn)生了矛盾。于是作者使用NanoTemper公司的nanoDSF技術(shù)建立了一套體外實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，用來(lái)評(píng)估RNP復(fù)合物的形成效率，從而佐證他們的結(jié)論。

通過(guò)nanoDSF這種無(wú)標(biāo)記技術(shù)，可在升溫過(guò)程中檢測(cè)蛋白中的色氨酸和酪氨酸的自發(fā)熒光。隨著升溫，儀器同步采集在350 nm和330 nm處的最大發(fā)射光位移，并自動(dòng)擬合出蛋白的熱展開(kāi)曲線。NanoDSF能夠檢測(cè)蛋白的構(gòu)象變化導(dǎo)致的熱穩(wěn)定性差異，并由熔解溫度(Tm)來(lái)表征蛋白的熱穩(wěn)定性。

由于Cas9是一種含有色氨酸和酪氨酸殘基的變構(gòu)酶， 因此利用nanoDSF技術(shù)可以簡(jiǎn)單、直觀地檢測(cè)導(dǎo)致Cas9重排的RNP復(fù)合物的形成。

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為了確定hiPSC中使用的dgRNA靶向GFP位點(diǎn)(dgRNA GFP)形成RNP復(fù)合物的有效性，作者使用恒定濃度的Cas9 (0.75 mM)與一定濃度范圍內(nèi)的dgRNA, 通過(guò)nanoDSF檢測(cè)，作出升溫誘導(dǎo)的蛋白變性曲線檢測(cè) (圖1A)。根據(jù)一階導(dǎo)數(shù)，可以確定Cas9單獨(dú)的Tm(TmCas9 = 43.2C)，以及Cas9/dgRNA摩爾比為1/1至1/5 的Tm：1/1 時(shí)TmRNP = 49.6 C、1/2 時(shí)TmRNP = 50.0 C、1/3時(shí) TmRNP = 49.9C、1/5 時(shí)TmRNP = 49.8 C (圖1B)。相比只有Cas9時(shí)， Cas9/dgRNA摩爾比為1/1至1/5 時(shí)的Tm都有明顯增加，但Cas9/dgRNA不同摩爾比之間的Tm并沒(méi)有顯著差異（圖1C）。這反映了RNP復(fù)合物的形成情況。另外，當(dāng)Cas9/dgRNA為等摩爾比時(shí)，是檢測(cè)不到游離Cas9的。因此，可以認(rèn)為Cas9/dgRNA等摩爾比是形成RNP復(fù)合物的最優(yōu)條件。

作者在大鼠胚胎上使用點(diǎn)突變模型來(lái)驗(yàn)證等摩爾Cas9/dgRNA是否能得到最佳的KI率，以及過(guò)量的dgRNA是否會(huì)影響KI效率。

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他們先使用nanoDSF檢測(cè)大鼠胚胎中Cas9過(guò)量、等摩爾Cas9/dgRNA或dgRNA過(guò)量這幾種情況下，RNP復(fù)合物的形成情況(圖2A)。在所有條件下，添加dgRNA靶向的環(huán)氧化物水解酶2基因(dgRNA rEphx2)，與單獨(dú)Cas9相比，Tm都顯著增加，表明RNP復(fù)合物的形成 (圖2B)。

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在Cas9/dgRNA摩爾比為 5/1和2/1時(shí)，可以看到變性曲線中包含了兩個(gè)熱變性峰，分別可表示為TmCas9和TmRNP。與單獨(dú)Cas9相比(TmCas9 = 43.2℃)， TmCas9對(duì)這兩種RNP的比例差異不顯著(TmCas9 RNP 5/1 = 43.0℃;TmCas9 RNP 2/1 = 43.3℃, p分別= 0.4809和0.9353)，而TmRNP為(TmRNP RNP 5/1 = 48.0℃;TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃, p 都= 0.029)。

這些結(jié)果表明，在兩個(gè)條件下，RNP復(fù)合物已經(jīng)形成，而游離Cas9仍然存在。當(dāng)?shù)饶柋?RNP 1/1)或dgRNA rEphx2過(guò)量(RNP 1/2, 1/3和1/5)時(shí)，只觀察到一個(gè)熱變性峰(TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃;TmRNP RNP 1/2 = 49.9℃;TmRNP RNP 1/3 = 49.8℃;TmRNP RNP 1/5 = 49.7℃)，這些Tm之間差異不顯著。此外，與dgRNA rEphx2相比，RNP 1/1比例的TmRNP與RNP 2/1比例的TmRNP顯著不同(TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃;TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃, p = 0.0206)，與單獨(dú)Cas9也顯著不同 (TmCas9 Cas9 = 43.2℃;TmRNP RNP 1/1 = 49.7C, p<0.0001)。

這說(shuō)明大多數(shù)Cas9形成了RNP復(fù)合體，RNP 1/1和dgRNA過(guò)量。由此同樣佐證了作者的結(jié)論，等摩爾比Cas9/gRNA這個(gè)條件限制了游離Cas9，可能也限制了游離dgRNA，最終有效形成RNP復(fù)合物。

03

關(guān)于PR系列蛋白穩(wěn)定性分析儀

德國(guó)NanoTemper公司自2014年推出PR系列蛋白穩(wěn)定性分析儀，以nanoDSF技術(shù)為核心，通過(guò)檢測(cè)蛋白內(nèi)源熒光，無(wú)需標(biāo)記即可檢測(cè)蛋白Tm值，快速精確評(píng)估蛋白在不同條件下的熱穩(wěn)定性變化。

2020年NanoTemper推出新一代PR Panta儀器，并于2022年整合四大技術(shù)模塊nanoDSF/Backreflection/DLS/SLS，可實(shí)時(shí)同步評(píng)估蛋白熱穩(wěn)定性，膠體穩(wěn)定性，聚集體與粒徑等信息，為科研人員在蛋白質(zhì)量控制、復(fù)合物分析、化合物篩選、制劑優(yōu)化等方面提供強(qiáng)大助力。

今年年初，公司憑借自身不斷創(chuàng)新的科學(xué)技術(shù)，推出新品型號(hào)：PR Panta + 機(jī)械臂自動(dòng)上樣器，這款新品擁有獨(dú)立且包羅萬(wàn)象的系統(tǒng)，包含機(jī)械臂、外框架、計(jì)算機(jī)和監(jiān)視器?？裳b載多達(dá)4個(gè)384微孔板，用于檢測(cè)所有蛋白質(zhì)候選分子熱變性、膠體穩(wěn)定性和化學(xué)變性的全自動(dòng)操作。可針對(duì)高通量或配方篩選實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景，無(wú)需手動(dòng)即可完成多達(dá)1536個(gè)樣品的檢測(cè)。

如您對(duì)我們產(chǎn)品或技術(shù)感興趣，

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