? ??糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是由糖尿病誘發(fā)的原發(fā)性心肌損傷，其發(fā)病機制復雜，或與心肌脂毒性和細胞死亡有關。DCM也是導致糖尿病患者死亡的主要原因。視黃醇（也稱維生素A，Retinol，Rol）和全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）是視黃醇代謝的產物，視黃醇脫氫酶（Retinol dehydrogenase 10，RDH10）是視黃醇代謝中的限速酶，在Rol轉化為atRA中起重要作用。有研究表明，補充atRA有助于預防糖尿病大鼠的心肌損傷[1]。目前，Rol和atRA水平在糖尿病小鼠心臟中是否會發(fā)生改變？又是否與DCM有關？另外RDH10是如何參與其中？這些問題尚未得到闡明。

2023年3月2日，中山大學蔡衛(wèi)斌教授及其團隊在《nature communications》（IF=17.694）上發(fā)表了題為《Retinol dehydrogenase 10 reduction mediated retinol metabolism disorder promotes diabetic cardiomyopathy in male mice》的研究論文，該研究證實了心臟RDH10的減少是視黃醇代謝紊亂的始動因素，并通過引起心肌脂毒性和鐵死亡導致DCM的發(fā)生發(fā)展。值得注意的是，作者使用了漢恒生物提供的腺相關病毒（AAV9），成功在db/db小鼠心臟中過表達了RDH10，助力作者闡明RDH10介導DCM的新機制。

下面我們一起來看看作者是如何挖掘其中的機制：

研究團隊的前期研究表明，db/db小鼠模型不僅是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）模型，而且是一個非常好的DCM模型，具有心臟功能從代償期到失代償期變化的典型模式。作者首先分別對4周齡、24周齡和32周齡的db/db小鼠的心臟進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）分析，結果發(fā)現(xiàn)分別有1695、2584和2147個DEGs（fold change≥1.5），其中對應有643、1293和1153個基因表達上調，1052、1291和994個基因表達下調（圖1 a）。接著，經KEGG和GO分類分析，顯示這三組小鼠樣本中共有215個DEGs發(fā)生顯著變化（圖1 b），且代謝途徑（mmu01100）相關的基因最多（圖1 c），其中Rol反應（GO：0033189）、視黃酸代謝途徑（GO：0042573）和視黃醇代謝途徑（GO：0042572）的顯著富集（p?<?0.001, q?<?0.001）（圖1 d）。

進一步分析DEGs中視黃醇代謝相關基因（mmu00830）的表達情況，結果顯示與視黃酸合成相關的基因表達逐漸下調，而與視黃酸降解相關的基因表達逐漸上調（圖1 e）。更重要的是，32周齡db/db小鼠心臟中Rol增加近一倍，atRA減少了一半，而RARα（視黃酸受體α）和RARβ顯著降低（圖1 f, g），表明T2DM小鼠的心臟中存在以Rol過載、atRA缺乏和RARs減少為特征的視黃醇代謝障礙。在T2DM患者的心臟中也發(fā)現(xiàn)RARs降低，提示患者心臟同樣存在視黃醇代謝紊亂（圖1 h）。

Fig 1. T2DM中心臟視黃醇代謝改變。（n表示生物學獨立的動物）

為了證明Rol過載在DCM中的作用，作者設定了一個實驗基線，在8周齡db/db小鼠出現(xiàn)穩(wěn)定高血糖時開始補充Rol，同時開始測量體重、血糖和心功能直到基線后24周。結果發(fā)現(xiàn)，補充Rol的db/db小鼠出現(xiàn)了心力衰竭，心臟中的Rol顯著增加，但atRA或視黃酸酯沒有增加（圖2 a-d）；同時心臟重構加劇，包括心肌纖維化、細胞凋亡、肌纖維碎裂和心肌細胞線粒體增加（圖2 e-g）。此外，作者發(fā)現(xiàn)Rol能降低db/db小鼠的高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗，并在一定程度上降低血脂異常（圖2 h, i）。這些結果表明，Rol對db/db小鼠的心肌損傷不是通過加重糖尿病來實現(xiàn)的，而是由于心臟中Rol過載。

Fig 2. 補充Rol的T2DM小鼠心臟視黃醇代謝狀態(tài)、結構、功能以及血清胰島素和脂質。（n表示生物學獨立的動物）

接著，作者給db/db小鼠補充atRA，使用同樣的方法探討atRA缺乏在DCM中的作用。在沒有補充atRA的db/db小鼠中出現(xiàn)了心力衰竭（圖3 a-c），而補充了atRA能恢復心臟atRA水平（圖3 d），并減輕了心臟重構（圖3 e-g），降低高胰島素血癥、胰島素抵抗以及一定程度的血脂異常（圖3 h, i）。這些結果提示，額外補充atRA可以通過恢復心臟atRA水平和改善全身代謝紊亂來預防T2DM小鼠的心肌損傷。

Fig 3. 補充有atRA的T2DM小鼠的心臟視黃醇代謝狀態(tài)，結構和功能以及血清胰島素和脂質。（n表示生物學獨立的動物）

上述實驗檢測了給與Rol補充的db/db小鼠的心臟中Rol和atRA水平（圖1 f和圖2 d）表明，T2DM小鼠心臟中Rol向atRA轉換受阻。隨后作者檢測了RDH10的表達，發(fā)現(xiàn)RDH10呈先增加后減少的趨勢（補充圖3 a, b, d），并且活性也顯著降低（補充圖3 c）。同時，發(fā)現(xiàn)T2DM患者心臟RDH10也明顯減少（補充圖3 d）。結果提示RDH10可能與T2DM中心臟視黃醇代謝紊亂及其引起的DCM密切相關。

補充材料 圖3. RDH10在T2DM小鼠和患者中表達情況。

為了進一步證實RDH10與心臟視黃醇代謝、心肌損傷的關系，作者使用MYH6-iCre小鼠與RDH10flox/flox小鼠雜交，獲得心肌細胞條件性RDH10基因敲除（RDH10-cKO）小鼠，然后注射他莫昔芬（TMX）誘導心肌細胞RDH10的敲除（圖4 a）。在持續(xù)給與TMX處理15周后，RDH10-cKO小鼠表現(xiàn)出心臟atRA水平減半（圖4 b）、心力衰竭（圖4 c, d）以及嚴重的心臟重構（包括心肌肥大、心肌纖維化、細胞凋亡、脂肪沉積和心肌細胞線粒體增加）（圖4 e-g）。這些結果表明，心臟RDH10的缺失及其導致的以atRA缺乏為主要表現(xiàn)的心臟視黃醇紊亂可以獨立地引起心肌損傷。

Fig 4. 心肌細胞條件性RDH10基因敲除小鼠的心臟視黃醇代謝狀態(tài)、結構和功能。（n 表示生物學獨立動物）

接著，作者探討了RDH10和心臟視黃醇代謝在DCM中的作用。作者在實驗基線后8周給db/db小鼠注射AAV9-RDH10，實現(xiàn)了心臟過表達RDH10，并在5周后恢復到與db/m小鼠相當?shù)乃剑▓D5 a）。同時，AAV9-RDH10減輕了db/db小鼠心臟視黃醇代謝紊亂（圖5 b），預防了心力衰竭（圖5 c, d），減輕了心肌損傷（包括心肌肥大、纖維化、細胞凋亡、脂質沉積以及線粒體數(shù)量）（圖5 e-g）。結果提示RDH10減少和心臟視黃醇代謝紊亂是T2DM患者發(fā)生DCM的主要原因。

Fig 5. 注射AAV9-RDH10的T2DM小鼠的心臟視黃醇代謝狀態(tài)、結構和功能。（n表示生物學獨立的動物）

已有研究表明DCM的心臟脂質沉積與游離脂肪酸（FFAs）過度攝取有關，而FFAs的攝取主要由脂肪酸轉位酶（FAT/CD36）介導[2-4]。前面的結果也提示著DCM中RDH10、視黃醇代謝紊亂和心肌脂毒性之間可能存在聯(lián)系（圖2-5 f）。通過油紅O染色和心臟甘油三酯（TG）的檢測，發(fā)現(xiàn)RDH10表達減少增加了db/db小鼠心肌的脂肪沉積和TG水平，而過表達RDH10可以拮抗這一過程，其中是atRA參與發(fā)揮了主要作用而不是Rol（圖6 a-f）。這表明RDH10的減少及其導致的視黃醇代謝紊亂使得atRA缺乏，從而促進T2DM的心臟脂毒性。對于新生小鼠原代心肌細胞（NMPC）脂質沉積的檢測，驗證這一結論；并且AGN193109（RARs抑制劑）可阻斷atRA的積極影響（圖6 g）。此外，RDH10的抑制通過減少atRA來促進CD36的表達，增加了心臟FFAs攝?。辉谘a充atRA后可逆轉這一現(xiàn)象（圖6 h-j）。這些結果表明，心臟RDH10減少通過降低心臟中atRA的水平來增加其脂質沉積和FFAs攝取，從而促進T2DM患者的心肌脂毒性。

Fig 6. RDH10減少誘導的視黃醇代謝紊亂通過使atRA缺乏介導T2DM小鼠脂質蓄積和FFAs攝取增加，促進心臟脂毒性（e，f，i和j中n表示生物學獨立的動物；而h中n表示獨立實驗）。

鐵死亡是依賴于鐵催化的脂質過氧化，并參與DCM的病變[5-6]。作者驗證了T2DM患者的心臟中也發(fā)生了鐵死亡。有研究表明，atRA可預防鐵過載引起的肝損傷，表明視黃醇代謝與鐵死亡之間存在聯(lián)系[7]。作者隨即檢測了RDH10-cKO小鼠心臟中脂質過氧化相關標志物的表達水平，發(fā)現(xiàn)4-羥基壬烯酸（4-HNE）和丙二醛（MDA）升高（圖7 a-d）；但在給與鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）治療后，不僅抑制了心臟4-HNE的積累，還挽救了小鼠的心力衰竭（圖7 e-h）；結果表明脂質過氧化引起的鐵死亡參與了RDH10-cKO小鼠的心肌損傷。作者進一步探究了心臟視黃醇代謝紊亂中與鐵死亡相關的脂質過氧化標志物。結果顯示，在RDH10-cKO小鼠的心臟中谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）表達下調（圖7 i），DHODH和SLC7A11沒有變化；而在NMPC中atRA逆轉了GPX4和FSP1的下調，可以被AGN193109阻斷（圖7 j, k）。這表明心臟視黃醇代謝紊亂使atRA減少通過抑制GPX4和FSP1表達，促進了脂質過氧化，導致心臟發(fā)生鐵死亡。此外，在db/db小鼠中過表達RDH10和補充atRA，逆轉了其心臟GPX4、FSP1的表達，并顯著減少了脂質過氧化水平（圖7 l, m）。結果提示視黃醇代謝紊亂使atRA減少，進而抑制GPX4和FSP1表達，促進了鐵死亡。

Fig 7. RDH10減少誘導的視黃醇代謝紊亂通過使atRA缺乏介導GPX4在T2DM心臟中減少，促進鐵死亡。（n表示生物學獨立的動物）

T2DM小鼠心臟鐵死亡也表現(xiàn)出了鐵的蓄積，但RDH10-cKO小鼠沒有（圖7 c, d）。隨后作者給與RDH10-cKO小鼠高鐵飲食喂養(yǎng)三周后，出現(xiàn)了心力衰竭和心臟鐵蓄積（圖8 a-e）。重要的是，注射AAV-RDH10和補充atRA可顯著抑制db/db小鼠心臟的鐵蓄積（圖8 f, g）。同時還檢測了轉鐵蛋白受體（TFRC）和鐵轉運蛋白1（FPN1）的水平，發(fā)現(xiàn)心臟視黃醇代謝變化只改變了FPN1的表達（圖8 h），而不改變TFRC。此外，atRA與核RARs相互作用后可作為轉錄因子，影響視黃醇代謝變化中GPX4、FSP1和FPN1的轉錄水平。總之，在T2DM中，RDH10的減少抑制了心臟atRA-RARs復合物的形成，導致GPX4、FSP1和FPN1表達下調，促進鐵死亡。

Fig 8. RDH10減少誘導的視黃醇代謝紊亂使T2DM心臟中atRA缺乏促進鐵蓄積。（n表示生物學獨立的動物）

綜上所述，作者報道了在T2DM中，RDH10減少會導致心臟視黃醇代謝紊亂，主要特征表現(xiàn)為Rol過載、atRA缺乏和RARs減少，并通過Rol過載引起的心臟毒性和atRA引起的脂毒性和鐵死亡促進DCM病變。作者研究提示，RDH10和atRA可能是通過逆轉視黃醇代謝紊亂來預防和治療DCM的潛在靶標，且Rol過量對心臟有害，因此T2DM患者應避免使用。

參考文獻：

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