基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的診斷技術(shù)自問世以來，其對(duì)無儀器核酸檢測(cè)技術(shù)的需求推動(dòng)了多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和快速檢測(cè)工具的發(fā)展。尤其以Cas12和Cas13為代表的單Cas酶反應(yīng)體系更是獲得快速發(fā)展，除在基因編輯領(lǐng)域已有諸多應(yīng)用外，在診斷領(lǐng)域的發(fā)展同樣迅速。本篇文章主要針對(duì)基于CRISPR/Cas技術(shù)的不同系統(tǒng)在診斷領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

CRISPR/Cas9診斷系統(tǒng)：在基因編輯和診斷領(lǐng)域，Cas9是最早被應(yīng)用和開發(fā)的。2016年，James Collins博士領(lǐng)導(dǎo)的國際小組通過把Cas9和PCR進(jìn)行結(jié)合開發(fā)了一種針對(duì)寨卡病毒分型的特異性檢測(cè)方法（圖1）[1]。但由于存在著Cas9只能靶向DNA、蛋白體積過大、脫靶效應(yīng)等方面的不足，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)且需要變溫反應(yīng)，該系統(tǒng)在診斷產(chǎn)品開發(fā)方向并未得到廣泛應(yīng)用。

與Cas9不同，Cas12或Cas13除了能夠在識(shí)別目標(biāo)序列后啟動(dòng)靶向切割活性，還具有非特異性性切割體系內(nèi)DNA或RNA的能力（即“反式切割活性”）。利用該反式切割活性，使帶有熒光基團(tuán)的報(bào)告分子釋放熒光，構(gòu)成了以Cas12或Cas13反式切割活性為基礎(chǔ)的CRISPR/Cas診斷技術(shù)：其中以SHERLOCK診斷系統(tǒng)、DETECTR診斷系統(tǒng)、HOLMES診斷系統(tǒng)以及CDetection診斷系統(tǒng)為代表。

SHERLOCK診斷系統(tǒng)：2017年，張峰及其同事提出了一種結(jié)合靶基因預(yù)擴(kuò)增技術(shù)（RPA或RT-RPA）與Cas13a酶活的診斷平臺(tái)——SHERLOCK診斷系統(tǒng)（圖2）[2]。該系統(tǒng)表現(xiàn)出的單分子檢測(cè)靈敏度及單堿基的特異性是CRISPR診斷領(lǐng)域中具有里程碑意義的重要工作，然而其只能定性而不能定量檢測(cè)，同時(shí)在擴(kuò)增與檢測(cè)之間需要開蓋轉(zhuǎn)移易造成氣溶膠污染。因此第二代SHERLOCK v2技術(shù)增加Csm蛋白和多種Cas蛋白，并將紙基傳感器引入系統(tǒng)，使結(jié)果可視且更快捷。此外，整個(gè)SHERLOCK v2反應(yīng)一步進(jìn)行，采用Cas13酶一步法（邊擴(kuò)增邊檢測(cè)）完成整個(gè)檢測(cè)過程。研究證明，SHERLOCK可以檢測(cè)Zika病毒、登革熱病毒、各種致病菌和DNA中的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。以該技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的新冠檢測(cè)產(chǎn)品在2020年5月獲得了新冠檢測(cè)的EUA，成為全球第一個(gè)注冊(cè)獲批的CRISPR診斷試劑。

DETECTR診斷系統(tǒng)：Cas12a（Cpf1）是一種CRISPR-Cas突變體，與Cas9類似，它也能切割雙鏈DNA，而Doudna實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了Cas12a切割非特異性（反式）單鏈DNA的能力，并利用這一能力創(chuàng)建了一個(gè)稱為DETECTR的DNA檢測(cè)平臺(tái)[3]。當(dāng)靶標(biāo)核酸存在時(shí)，通過恒溫?cái)U(kuò)增（RPA）特定產(chǎn)物，并通過Cas12a和sgRNA復(fù)合物進(jìn)行特異性識(shí)別，同時(shí)激活Cas12a反式切割活性，將FQ-ssDNA報(bào)告探針切割并發(fā)出熒光。

DETECTR系統(tǒng)從流程上更有優(yōu)勢(shì)，不僅步驟上更少，而且所用到的探針為ssDNA探針，合成便宜且保存穩(wěn)定。為了解決兩步法的氣溶膠污染以及提高檢測(cè)靈敏度和特異性，同樣將恒溫?cái)U(kuò)增與基于Cas12a的CRISPR檢測(cè)整合在一個(gè)系統(tǒng)中，將檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)從2個(gè)小時(shí)縮短至30分鐘內(nèi)。

HOLMES診斷系統(tǒng)：同樣是利用Cas12a的反式切割活性，國內(nèi)王金教授團(tuán)隊(duì)通過PCR步驟實(shí)現(xiàn)模板擴(kuò)增開發(fā)了HOLMES系統(tǒng)（圖4）[4-5]。隨后，該團(tuán)隊(duì)又基于LAMP-Cas12b開發(fā)了HOLMES v2系統(tǒng)，并開發(fā)了One-Pot一步法CRISPR診斷體系，同時(shí)，HOLMES v2可與digital PCR體系聯(lián)用實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)核酸的絕對(duì)定量。測(cè)試數(shù)據(jù)顯示，Cas12b的反式切割活性對(duì)ssDNA的親和力要好于dsDNA，具有更寬的反應(yīng)溫度范圍，而且靈敏度與Cas12a相當(dāng)，同時(shí)該團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)優(yōu)化了Cas12a的反應(yīng)系統(tǒng)，定義了其反式裂解單位（transU）[6]。在專利方面，王金教授與張峰教授達(dá)成了中美市場(chǎng)的專利“交叉授權(quán)”合作，共同推進(jìn)CRISPR診斷產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

CDetection診斷系統(tǒng)：由中國科學(xué)院周淇院士團(tuán)隊(duì)開發(fā)的具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的CDetection診斷系統(tǒng)，采用具有較寬反應(yīng)溫度范圍（25-60℃）和pH穩(wěn)定性（1-8）的AaCas12b，通過AaCas12b-sgRNA復(fù)合物特異性識(shí)別靶標(biāo)基因后，激活其反式切割活性，高效的切割體系內(nèi)ssDNA熒光報(bào)告分子，從而發(fā)出熒光信號(hào)，該系統(tǒng)能夠適應(yīng)不同環(huán)境下的檢測(cè)條件。使用RT-RAA和Cas12b優(yōu)化系統(tǒng)成分和反應(yīng)條件，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種Cas12b輔助的one-pot檢測(cè)平臺(tái)（CDetection v2），能夠在30分鐘內(nèi)快速檢測(cè)SARS-CoV-2，而不與其他病毒交叉反應(yīng)[7-8]。

基于CRISPR的分子診斷技術(shù)簡(jiǎn)單、快速，搭載恒溫?cái)U(kuò)增則無需復(fù)雜儀器，不同特性Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)，豐富了檢測(cè)核酸類型的選擇，從dsDNA到ssDNA再到RNA，均可作為CRISPR/Cas分子診斷系統(tǒng)的靶序列，結(jié)合各種可視化反應(yīng)，為分子即時(shí)診斷的應(yīng)用帶來更多發(fā)展可能（表1）。

表1 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的診斷技術(shù)

珠海舒桐醫(yī)療科技有限公司長(zhǎng)期致力于基因編輯領(lǐng)域，研發(fā)團(tuán)隊(duì)潛心研發(fā)，具備完善的CRISPR/Cas分子克隆平臺(tái)以及相關(guān)蛋白純化技術(shù)，有著豐富的體外診斷經(jīng)驗(yàn)以及研發(fā)管線。今年2月，舒桐自研高保真CRISPR-FrCas9獲國際專利授權(quán)，本項(xiàng)專利CRISPR-FrCas9是目前已知的切割效率最強(qiáng)、脫靶效應(yīng)最低、特異性最好、PAM限制最少的CRISPR，顯著優(yōu)于SpCas9。此外，珠海舒桐醫(yī)療是國內(nèi)首家提供脫靶檢測(cè)服務(wù)的公司，可提供GUIDE-seq體內(nèi)脫靶檢測(cè)、AID-seq體內(nèi)脫靶檢測(cè)等多種服務(wù)，歡迎垂詢。

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珠海舒桐醫(yī)療科技有限公司深耕基因編輯技術(shù)10余年，是一家以基因編輯為核心技術(shù)的生物醫(yī)藥服務(wù)企業(yè)，可承接脫靶檢測(cè)、細(xì)胞株定制、病毒包裝等CRO及CDMO業(yè)務(wù)。目前，舒桐科技擁有3000㎡的GMP研發(fā)實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)車間；擁有博士后科研工作站及澳門理工大學(xué)教學(xué)科研實(shí)習(xí)基地。研發(fā)團(tuán)隊(duì)熟練掌握各類基因編輯技術(shù)，包括基因編輯、堿基編輯及先導(dǎo)編輯等，成功完成如基因敲除、點(diǎn)突變、大片段插入、過表達(dá)等細(xì)胞系構(gòu)建項(xiàng)目；開發(fā)了多種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的脫靶檢測(cè)技術(shù)，建立了高通量的sgRNA篩選平臺(tái)；建立了工廠化新型CRISPR挖掘體系，已開發(fā)出多種切割效率高且低脫靶的新型CRISPR。公司目前已申請(qǐng)基因編輯、脫靶檢測(cè)、新型CRISPR及藥物遞送等專利70+項(xiàng)，授權(quán)50+項(xiàng)。同時(shí)，公司具備先進(jìn)的CGT原料規(guī)?；a(chǎn)能力，產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到領(lǐng)先水平，可為科研機(jī)構(gòu)及生物醫(yī)藥企業(yè)提供安全高效的一站式服務(wù)和原料供應(yīng)。舒桐科技堅(jiān)持以“創(chuàng)新、敬業(yè)、融合、開放”為核心價(jià)值觀，致力于利用基因治療技術(shù)造福人類健康，讓生命更美好。

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參考文獻(xiàn)：

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