背景

克羅恩病(CD)是一種炎癥性腸病(IBD), 其特征是胃腸道的慢性和復(fù)發(fā)性炎癥，附著在腸壁外部的肥大腸系膜脂肪被稱為爬行脂肪(CrF)，它是 CD的獨(dú)特標(biāo)志。CrF已被認(rèn)為在CD的進(jìn)展中起積極作用，但腸膜脂肪組織(MAT)內(nèi)的細(xì)胞組成及其在CrF形成中的潛在機(jī)制尚不清楚。因此這篇文章旨在利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（scRNA-seq）來全面構(gòu)建CrF和MAT的細(xì)胞圖譜，并闡述了CrF形成過程中細(xì)胞成分的功能多樣性和動(dòng)態(tài)變化，為基于MAT的治療的深入研究和潛在靶點(diǎn)提供未來的方向。

作者對(duì)來自3對(duì)手術(shù)切除的CrF和MAT樣本的67064個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq。在CrF中，首次鑒定出高表達(dá)脂蛋白脂酶的特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞亞群，并且發(fā)現(xiàn)了一種主要存在于CrF中的高表達(dá)GREM1和RFLNB新型炎癥相關(guān)成纖維亞群（F3）。此外，還首次解析了髓系6個(gè)巨噬細(xì)胞亞群的不同起源和功能。該結(jié)果揭示了CD中MAT的細(xì)胞異質(zhì)性以及這些不同的細(xì)胞組成在CrF發(fā)展中的作用。

結(jié)果一

單細(xì)胞表達(dá)圖譜揭示了CD中 MAT的多種細(xì)胞類型

OEBIOTECH

為了研究CD中細(xì)胞群的異質(zhì)性以及MAT的分子和通路特征，作者對(duì) CD患者回腸炎癥狹窄的3個(gè)CrF和相鄰的uMAT樣本對(duì)進(jìn)行scRNA-seq(圖1A)。共獲得67 064個(gè)高質(zhì)量單細(xì)胞(圖1B)?；诘湫偷膍arker 基因的表達(dá)情況最終鑒定出10種不同的細(xì)胞類型(圖1D, E)，包括內(nèi)皮細(xì)胞（Ecs）， B細(xì)胞，漿細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和t & NK細(xì)胞。與uMAT相比，CrF漿細(xì)胞明顯擴(kuò)增，而其他細(xì)胞類型在兩組間無顯著差異(圖1G和圖S2)。這些分析表明，在CD患者中MAT存在復(fù)雜的細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)。由于ECs、成纖維細(xì)胞和髓系細(xì)胞之前被描述為與CrF的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，所以對(duì)這些細(xì)胞類型的異質(zhì)性和功能做了進(jìn)一步的研究。

圖1 | 單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示了CrF及其鄰近uMAT的細(xì)胞異質(zhì)性

結(jié)果二

一種特殊的高表達(dá)LPL的VECs亞群可能通過過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路參與CrF的形成

OEBIOTECH

作者將ECs進(jìn)一步分為5個(gè)亞簇(圖2A)，其中 4個(gè)簇(VEC1-4)標(biāo)記為血管ECs (VECs)，一個(gè)簇標(biāo)記淋巴管EC (LECs,圖2 B)，CrF中VEC2的比例明顯高于uMAT（圖2C)。熱圖顯示BTNL9、CD300LG、CA4、LPL和FMO2是VEC2中表達(dá)量最高的5個(gè)基因(圖2D), LPL被認(rèn)為是一種成脂標(biāo)記物, CrF中LPL+PECAM1+ ECs的比例高于uMAT(圖2E)。

GSVA分析顯示VEC2主要參與甘油三酯和中性脂分解代謝過程以及對(duì)細(xì)菌的反應(yīng) (圖2F)。KEGG分析表明，在VEC2中，PPAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂肪消化吸收得到了強(qiáng)有力的富集(圖2G) 。為了進(jìn)一步研究VEC2在CrF和uMAT之間的功能區(qū)別，作者進(jìn)行了DEGs檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CrF中VEC2金屬硫蛋白的表達(dá)水平顯著升高(圖2H)。CrF衍生的VEC2中高表達(dá)了三個(gè)與脂肪代謝相關(guān)的基因，包括FABP4、PLIN2和PLA2G2A (圖2H)。結(jié)果表明，CrF中的VEC2具有增強(qiáng)的促血管生成和成脂特性。

通過SCENIC分析，PPARγ調(diào)節(jié)子在VEC2中表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄活性(圖2I和圖S3B)，其僅在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(圖2J)。在所有血管亞群中，PPARγ在VEC2中的表達(dá)最高(圖2K和圖S3C)，表明其在該亞群的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的重要作用。富集分析結(jié)果表明PPAR信號(hào)系統(tǒng)在所有涉及的通路中排名第一，并且其靶基因多與脂質(zhì)代謝有關(guān)。這些分析結(jié)果表明，PPAR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)VEC2的功能中是至關(guān)重要的，特別是在成脂反應(yīng)中。

圖2 | ECs的亞群分析揭示了一種特殊的VECs亞群

結(jié)果三

CrF來源的LECs上調(diào)淋巴管生成和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)和通路

OEBIOTECH

DEGs分析顯示CD74是CrF的LECs中上調(diào)最多的基因，CD74促進(jìn)ECs增殖并與管壁的高滲透性相關(guān)。FABP5在CrF的LECs中也顯著上調(diào)，F(xiàn)ABP5可在多種細(xì)胞類型中表達(dá)，并影響細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)。在本研究中還觀察到FABP5通過結(jié)合FAs激活核內(nèi)PPAR通路并參與脂質(zhì)代謝 (圖3B)。根據(jù)GO分析結(jié)果，IFN-γ介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和JAK-STAT通路在CrF的LECs中得到增強(qiáng)(圖3C)。

通過SCENIC分析，發(fā)現(xiàn)CrF中的肌腱膜纖維肉瘤(MAF)調(diào)控具有最高的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度(圖3D)。它干預(yù)ECs的凋亡和分化，并對(duì)淋巴數(shù)量和功能產(chǎn)生潛在影響。通過計(jì)算CSI得到了一個(gè)由10個(gè)模塊和37個(gè)調(diào)控子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖3E)。模塊2中ATF3/JUND異二聚體的轉(zhuǎn)錄因子在CrF-LECs中表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性(圖3F),并與慢性炎癥相關(guān)。這些分析結(jié)果表明CrF衍生的LECs增加了參與炎癥反應(yīng)和淋巴管生成的基因表達(dá)，靶向治療CrF中異常的LECs可能是緩解CD腸道炎癥的一種有效的方法。

圖3 | LECs基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的變化

結(jié)果四

在CrF中檢測(cè)到與炎癥和纖維化相關(guān)的GREM1+RFLNB+炎癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的新亞群

OEBIOTECH

對(duì)成纖維細(xì)胞又分成7個(gè)亞簇(FC1-FC7，圖4A)， FC3是一個(gè)先前未報(bào)道的并且高表達(dá) GREM1和RFLNB的亞群 (圖4C)，CrF組GREM1+ RFLNB+細(xì)胞比例明顯高于uMAT組(圖4D, E)。基于3種基因標(biāo)記(CCL2、IL-6和IRF1表S2)，F(xiàn)C3細(xì)胞被認(rèn)為是炎癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞(IAFs)。GSVA分析表明，F(xiàn)C3主要參與炎癥反應(yīng)(IgA產(chǎn)生和Th17細(xì)胞分化（圖4F)和Smad蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)(圖4G)。GREM1 + RFLNB + IAFs首先主要在CrF中發(fā)現(xiàn)，并在促炎反應(yīng)和腸纖維化中顯示出潛在的能力。

圖4 | MAT中的成纖維細(xì)胞分為7個(gè)亞群

結(jié)果五

擬時(shí)序分析IAFs在CrF形成過程中的促炎和促纖維化特性

OEBIOTECH

在擬時(shí)序分析中2例患者的成纖維細(xì)胞經(jīng)歷了相似的3種狀態(tài)的軌跡路徑(圖5C, D)。uMAT來源的成纖維細(xì)胞主要位于分支前(state1)，而CrF來源的成纖維細(xì)胞主要位于state2 (圖5E, F)，表明CrF形成過程中存在過渡狀態(tài)。處于state 3的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為中間表型(圖5G, H)。GREM1 + RFLNB + IAF亞群的細(xì)胞分布與CrF來源的成纖維細(xì)胞高度匹配，證實(shí)了它們的主要來源是CrF。

基因動(dòng)力學(xué)分析(圖5I, J)顯示，state2顯著上調(diào)的基因集中在膠原合成、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控、IL-17和TNF信號(hào)通路。state 3以免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因和NF-κB信號(hào)通路表達(dá)為特征。此外，與許多纖維化疾病相關(guān)的CrF源性成纖維細(xì)胞中亞油酸的強(qiáng)大代謝活性也富集在FC3中(圖5K, L)。因此，F(xiàn)C3亞群作為主要來自CrF的IAFs，可能在促進(jìn)炎癥和纖維化中起著至關(guān)重要的作用。為了進(jìn)一步揭示成纖維細(xì)胞致病行為的潛在機(jī)制。SCENIC分析結(jié)果顯示5個(gè)調(diào)控信號(hào)在CrF來源的成纖維細(xì)胞中顯示出增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性(圖5M)。REL和NF-κB1作為NF-κB系統(tǒng)的主要成員，在促炎和促纖維化反應(yīng)中得到了很好的研究，該結(jié)果為通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄來干預(yù)炎癥和纖維化行為提供了新的見解。

圖5 | 擬時(shí)序分析和基因變化探索成纖維細(xì)胞的發(fā)育軌跡

結(jié)果六

CD的MAT中巨噬細(xì)胞來源和功能的異質(zhì)性

OEBIOTECH

共檢測(cè)到9個(gè)髓系簇(圖6A)，并鑒定出巨噬細(xì)胞，常規(guī)樹突狀細(xì)胞和髓樣祖細(xì)胞(圖6 B)三種細(xì)胞類型。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞占據(jù)了MAT中髓系細(xì)胞群體的絕大部分(圖6C)?；驘釄D顯示(圖6D)，C1是一種抗炎表型（IL-10）；C3（CCL8）呈現(xiàn)促炎特性并且載脂蛋白A1在C3中高表達(dá)；C4被定義為單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞（S100A8、S100A12）；C5/C6(MERTK、GPR34)都被認(rèn)為是組織中的巨噬細(xì)胞；C8（C1Q、SELENOP）是免疫調(diào)節(jié)相關(guān)巨噬細(xì)胞群。

GSVA分析(圖6E，F(xiàn))發(fā)現(xiàn)，C1富含血清素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，血清素調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的表型和功能極化，維持其抗炎狀態(tài)。此外，GSEA顯示出CrF中巨噬細(xì)胞吞噬作用的顯著增強(qiáng)(圖6G)，這與其防御細(xì)菌易位的能力一致。

圖6 | CD的MAT中巨噬細(xì)胞亞群起源和功能的異質(zhì)性

結(jié)果七

CD中MAT的細(xì)胞間通訊

OEBIOTECH

細(xì)胞通訊分析結(jié)果表明成纖維細(xì)胞與其他細(xì)胞類型相互作用最廣 (圖7B, C)，特別是與ECs。成纖維細(xì)胞和LECs在CrF中表現(xiàn)出最強(qiáng)烈的相互作用(圖7D)，而在uMAT中發(fā)現(xiàn)與VECs的交流最強(qiáng)(圖7E)。

巨噬細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，在MAT中與其他細(xì)胞類型的相互作用最多(圖7E)。在CrF中，IL-1β與巨噬細(xì)胞上的經(jīng)典受體IL-1β r聯(lián)合在成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，可將M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為m1炎性表型，加劇疾病發(fā)展(圖7G)。CrF中的成纖維細(xì)胞和LECs都產(chǎn)生了與巨噬細(xì)胞上的受體LRP1結(jié)合的MDK(圖7G, H)。

MDK-LRP1軸在促進(jìn)免疫抑制巨噬細(xì)胞的分化中起著至關(guān)重要的作用，即M2表型，促進(jìn)CrF的形成和纖維化。該研究揭示了MAT在CD中細(xì)胞-細(xì)胞通信的多樣性，并強(qiáng)調(diào)了成纖維細(xì)胞、ECs和巨噬細(xì)胞在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵作用。

圖7 | CrF和uMAT之間的細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)

文章亮點(diǎn)點(diǎn)評(píng)

這篇文章通過scRNA-seq來全面構(gòu)建CrF和MAT的細(xì)胞圖譜，并闡述了CrF形成過程中細(xì)胞成分的功能多樣性和動(dòng)態(tài)變化，不僅首次鑒定出高表達(dá)脂蛋白脂酶的特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞亞群，并且發(fā)現(xiàn)了一種主要存在于CrF中的新型炎癥相關(guān)成纖維亞群，還首次解析了巨噬細(xì)胞亞群的不同起源和功能，為基于MAT的治療的深入研究和潛在靶點(diǎn)提供未來的方向。