光遺傳學(xué)通過(guò)時(shí)空控制神經(jīng)回路中特定類(lèi)型的神經(jīng)元，徹底改變了對(duì)神經(jīng)科學(xué)的認(rèn)識(shí)。聚焦超聲(FUS)產(chǎn)生的機(jī)械發(fā)光是一種非侵入性原位光子發(fā)射工具，但目前還沒(méi)有一種用于時(shí)空光遺傳學(xué)的生物兼容性液態(tài)機(jī)械發(fā)光系統(tǒng)。

2023年1月6日，美國(guó)德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校王輝亮教授和斯坦福大學(xué)洪國(guó)松教授團(tuán)隊(duì)在JACS 雜志發(fā)表了題為“Ultrasound-Triggered In Situ Photon Emission for Noninvasive Optogenetics”的文章。該團(tuán)隊(duì)研發(fā)了脂質(zhì)體(Lipo@IR780/L012)納米顆粒，用于腦光子傳輸中FUS觸發(fā)的機(jī)械發(fā)光。

通過(guò)靜脈注射Lipo@IR780/L012納米顆粒在血液中循環(huán)，在FUS照射下，基于脂質(zhì)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在體液中產(chǎn)生了同步穩(wěn)定的藍(lán)光發(fā)射，對(duì)表達(dá)視蛋白的神經(jīng)元進(jìn)行光遺傳刺激，如方案1圖示。

方案1.Lipo@IR780/L012a的FUS觸發(fā)藍(lán)光發(fā)射示意圖

為進(jìn)行無(wú)創(chuàng)深部腦光遺傳刺激，通過(guò)薄膜水合策略制造FUS觸發(fā)的納米光源(Lipo@IR780/L012）（圖1a），這種光源有三種主要成分：發(fā)光化合物L(fēng)012、聲敏劑IR780和脂質(zhì)載體。

其原理為聲敏劑IR780通過(guò)聲空化將超聲波能量傳遞給附近的氧氣或水分子，產(chǎn)生活性氧(ROS)，主要是單線態(tài)氧(1O2)和羥基自由基(·OH)。隨后，激活發(fā)光化合物L(fēng)012產(chǎn)生光，從而激活表達(dá)視蛋白的特定類(lèi)型神經(jīng)元，以控制動(dòng)物行為或?qū)?lái)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

圖1.Lipo@IR780/L012的納米性能

通過(guò)體液模擬溶液中的動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和FUS照射評(píng)估Lipo@IR780/L012納米顆粒穩(wěn)定性。在含10%胎牛血清（FBS）的溶液中孵育或FUS照射后，沒(méi)有明顯的尺寸變化（圖1d）。

作為L(zhǎng)ipo@IR780/L012納米光源的主要觸發(fā)器，ROS與L012的快速反應(yīng)激活系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。因此，首先研究了在Lipo@IR780納米顆粒中產(chǎn)生ROS的類(lèi)型。

二苯基異苯并呋喃(DPBF)和水楊酸(SA)探針用來(lái)檢測(cè)FUS照射下1O2和·OH的生成，如圖2a所示。紫外可見(jiàn)吸收(UV?Vis) 降解光譜結(jié)果表明，1O2、·OH殘基均由Lipo@IR780產(chǎn)生。因較高水平ROS可氧化直接殺死細(xì)胞，為進(jìn)一步評(píng)估脂質(zhì)體包裹Lipo@IR780/L012后·OH和1O2的濃度。

結(jié)果表明，在FUS照射下，LiPO@IR780/L012(圖2f?g)中沒(méi)有ROS殘基從脂質(zhì)體中逸出，因生成的ROS被L012迅速消耗而發(fā)出藍(lán)光。

圖2.FUS誘導(dǎo)Lipo@IR780納米顆粒產(chǎn)生ROS

數(shù)據(jù)顯示，LiPO@IR780/L012的機(jī)械發(fā)光光譜，覆蓋了通道視紫紅質(zhì)-2(ChR2)吸收光譜和CheRiff吸收光譜，表明LiPO@IR780/L012適合激活ChR2進(jìn)行光遺傳刺激。在FUS照射下，LiPO@IR780/L012納米顆粒發(fā)射470 nm藍(lán)光，進(jìn)一步光密度量化分析顯示，Lipo@IR780/L012 納米顆粒的光發(fā)射隨 FUS 峰值壓力線性增加(圖3d)，這表明LiPO@IR780/L012納米粒子的發(fā)光速率由ROS濃度決定。

FUS輻射的高時(shí)間分辨率光發(fā)射對(duì)于通過(guò)聲光遺傳學(xué)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定神經(jīng)元活動(dòng)的精確控制十分重要。改變輻照脈沖，納米顆粒對(duì)輸出光子具有良好的穩(wěn)定性，對(duì)光線強(qiáng)度無(wú)影響(圖3f)。

接下來(lái)，用豬皮模擬正常腦組織來(lái)評(píng)估Lipo@IR780/L012納米顆粒的非侵入性激活，如圖3g所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lipo@IR780/L012系統(tǒng)對(duì)重復(fù)、無(wú)創(chuàng)的聲光遺傳學(xué)刺激具有良好的可靠性和同步性。

圖3.FUS激活LIPO@IR780/L012發(fā)光

為評(píng)估在重復(fù)的FUS照射下視蛋白的激活情況，利用組成性表達(dá)藍(lán)光激活的視蛋白CheRiff-eGFP刺激人胚胎腎臟293(HEK)細(xì)胞，如圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HEK細(xì)胞峰值只在機(jī)械發(fā)光發(fā)生時(shí)被激發(fā)。

接下來(lái)，在HEK細(xì)胞中評(píng)估Lipo@IR780/L012納米顆粒的生物安全性和生物相容性。通過(guò)細(xì)胞活性和溶血試驗(yàn)驗(yàn)證，Lipo@IR780/L012納米粒是足夠安全的，可以進(jìn)一步在體內(nèi)應(yīng)用。

圖4.Lipo@IR780/L012的體外聲光遺傳學(xué)刺激和生物安全性測(cè)試

為了直觀地評(píng)估聲光腦刺激，FUS傳感器與小鼠頭皮直接接觸，對(duì)運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)域進(jìn)行照射（圖5a），跟蹤小鼠肢體運(yùn)動(dòng)評(píng)估激活情況。在關(guān)節(jié)上標(biāo)記不同的彩色點(diǎn)以追蹤運(yùn)動(dòng)，髖關(guān)節(jié)-膝關(guān)節(jié)（θ）和膝關(guān)節(jié)-腳（φ）對(duì)FUS反應(yīng)的運(yùn)動(dòng)關(guān)節(jié)角度變化通過(guò)DeepLabCut追蹤和計(jì)算。

圖5.體內(nèi)聲光遺傳學(xué)運(yùn)動(dòng)皮層刺激

總 結(jié)

該研究開(kāi)發(fā)了一種基于有機(jī)脂質(zhì)載體、聲敏劑IR780和化學(xué)發(fā)光L012的生物相容性機(jī)械發(fā)光系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)在FUS下對(duì)神經(jīng)活動(dòng)的非侵入性光遺傳刺激。體外實(shí)驗(yàn)表明，在不同的刺激頻率下，Lipo@IR780/L012被FUS觸發(fā)，激活HEK細(xì)胞的CheRif表達(dá)峰值。

體內(nèi)光遺傳刺激進(jìn)一步證明，Thy1-ChR2-YFP轉(zhuǎn)基因小鼠靜脈注射脂質(zhì)納米顆粒后，在重復(fù)的FUS照射下，運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元被無(wú)創(chuàng)地可逆地激活，以實(shí)現(xiàn)肢體運(yùn)動(dòng)。值得注意的是，目前FUS的軸向分辨率是毫米級(jí)的，開(kāi)發(fā)亞毫米分辨率的FUS對(duì)于更具體的神經(jīng)調(diào)制是勢(shì)在必行的。

參考文獻(xiàn)：

Wang, Wenliang et al. “Ultrasound-Triggered In Situ Photon Emission for Noninvasive Optogenetics.” Journal of the American Chemical Society vol. 145,2 (2023): 1097-1107. doi:10.1021/jacs.2c10666

編譯作者：香蕉牛奶（brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì)）

校審：Simon（brainnews編輯部）