一大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但提取方法有很多種，今天小助手介紹幾種最常用的方法：

01小量質(zhì)粒DNA的提取

一、堿裂解法：

此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下：

1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。

2、37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

3、取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15ml預(yù)冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。

7、以10,000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管。

8、加入等體積的異戊醇，混勻后于0℃靜置10min。

9、再以10,000rpm離心20min，棄上清。

10、用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11、待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中.

二、煮沸法:

1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入Ep管中,4℃下12000rpm離心30秒。?

2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。?

3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。?

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。

5、將Ep管放入沸水浴中,50秒后立即取出。?

6、用微量離心機(jī)4℃下12000rpm離心10分鐘。

7、用無菌牙簽從Ep管中去除細(xì)菌碎片。?

8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。?

[注意]

1. 對(duì)大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落直接進(jìn)行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時(shí),細(xì)菌裂解效果反而不好。有時(shí)不同溶菌酶也能溶菌。?

3. 提取的質(zhì)粒DNA中會(huì)含有RNA,但RNA并不干擾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應(yīng)等。

02質(zhì)粒DNA的大量提取和純化?

在制作酶譜、測定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒DNA。

一、堿裂解法快速大量提取質(zhì)粒DNA的基本步驟?

1、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml，4℃下5000rpm離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。?

2、將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中（此步可省略）。?

3、同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。?

4、將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。?

5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。?

6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。

7、4℃下5000rpm離心15分鐘。?

8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分鐘。?

9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000rpm離心10分鐘。?

10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000rpm離心10分鐘。?

11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。?

12、4℃下12000rpm離心15分鐘, 沉淀用70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000rpm離心5分鐘。?

13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。?

[注意]

1. 提取過程中應(yīng)盡量保持低溫。?

2. 加入溶液II和溶液III后操作應(yīng)混和,切忌劇烈振蕩。?

3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時(shí)應(yīng)先對(duì)該酶液進(jìn)行熱處理(80℃ 1小時(shí)),使DNA酶失活。

二、提取質(zhì)粒DNA后需進(jìn)一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。

二質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，應(yīng)選用電泳純的，瓊脂糖此級(jí)產(chǎn)品篩除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙錠染色后熒光背景最小。

1、瓊脂糖凝膠電泳裝置

由于瓊脂糖凝膠電泳既要求不高，而適應(yīng)性又強(qiáng)，在過去15年里已成功地設(shè)計(jì)了形形色色及大大小小的電泳槽。對(duì)這些裝置的選擇主要是依據(jù)個(gè)人的喜惡。使用最普遍的裝置是Walter Schaffner發(fā)明的水平板凝膠。

水平板凝膠通常在一塊可安放于電泳槽平臺(tái)的玻璃板或塑料盤上灌制。在有些裝置中，則可將凝膠直接鋪在平臺(tái)上。凝膠恰好浸在緩沖液液面下進(jìn)行電泳。凝膠的電阻幾乎與緩沖液的電阻相同，所以有相當(dāng)一部分的電流將通過凝膠的全長。

2、瓊脂糖凝膠的制備

瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。通貫?zāi)z的電場接通后，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移。

3、瓊脂糖凝膠的染色

電泳完畢，將瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移入含EB的染液中，染色10分鐘，取出，紫外燈下觀察。

三大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

感受態(tài)的細(xì)胞可以攝入外部溶液中的DNA，而常態(tài)的細(xì)胞卻不能，所以要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA進(jìn)入大腸桿菌必須首先制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞。

1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜

2、取0.1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.3?

3、然后把培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min。

4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液。

5、把菌體懸浮于15ml 冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min。

6、然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液。

7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。

四質(zhì)粒DNA高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌

制備好感受態(tài)細(xì)胞后，接下來就是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞的過程。但要注意的是感受態(tài)細(xì)胞最好是新制備的，因?yàn)楸４嬉欢〞r(shí)間的感受態(tài)細(xì)胞會(huì)使轉(zhuǎn)化率降低；此外DNA的濃度也要注意，不能太高。

1、取新制備的一管感受態(tài)細(xì)胞。

2、取0.03ml感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)和4ng質(zhì)粒DNA混勻，置冰浴30min。

3、將 Ep管置于42℃水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘。

4、在 Ep管中加70ul LB培養(yǎng)基混勻，37℃培養(yǎng)30min。

5、涂在含適當(dāng)濃度抗生素的LB平板上。

6、37℃培養(yǎng)過夜，長出的菌斑既為陽性克隆。?

五線形質(zhì)粒DNA 5'-粘性末端去磷酸

經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒DNA 5'端均帶有磷酸集團(tuán)，如用此載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其自身環(huán)化幾率非常高，影響連接、轉(zhuǎn)化效率。因此一般酶切的質(zhì)粒DNA要經(jīng)脫磷，使用堿性磷酸酶(CIAP)去除5'端磷酸集團(tuán)。方法如下：

1、質(zhì)粒DNA和CIAP以及BUFFER 37℃水浴30min。

2、補(bǔ)充CIAP 再37℃水浴30min。

3、加入50mM EDTA至終濃度5mM 75℃加熱10min 失活CIAP。

4、冷卻至室溫，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀濃縮。

5、抽干溶液，加適量TE溶解。