寫在前面

????????今天推薦的是由美國北卡羅來納大學(xué)Lineberger綜合癌癥中心在2020年9月18日發(fā)表于ScienceAdvances（2020IF：14.136，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Yan-pingXu教授，研究表明USP15通過去泛素化和TET2失活抑制腫瘤免疫。

研究背景

????????TET2 DNA二氧酶在人類造血性惡性腫瘤中經(jīng)常發(fā)生突變，并在許多實(shí)體瘤中通過非突變機(jī)制實(shí)現(xiàn)功能失活。

摘要部分

????????先前的研究表明TET2介導(dǎo)干擾素JAK-STAT通路以刺激淋巴細(xì)胞(TIL)的趨化因子表達(dá)和腫瘤浸潤。TET2在K1299處被單泛素化，從而促進(jìn)其活性。在這里，作者報(bào)道Usp15是一種TET2去泛素化酶和抑制劑。Usp15催化去除K1299連接的單泛素并負(fù)調(diào)節(jié)TET2活性?；虮磉_(dá)譜表明TET2和Usp15反向調(diào)節(jié)參與多種炎癥通路的基因，TET2是Usp15功能的主要目標(biāo)。黑色素瘤中Usp15的缺失以TET2依賴性方式刺激趨化因子表達(dá)和TIL，導(dǎo)致對(duì)免疫治療的反應(yīng)增加并延長荷瘤小鼠的壽命。這些結(jié)果揭示了以前未知的TET2活性調(diào)節(jié)劑，并表明Usp15作為實(shí)體瘤免疫治療的潛在治療靶點(diǎn)。

研究內(nèi)容

1.USP15與TET2結(jié)合??? ? ?

????????為了鑒定TET2的DUB，作者建立了穩(wěn)定表達(dá)FLAG-TET2的293T細(xì)胞，然后異位表達(dá)WT DCAF1。作為對(duì)照，作者異位表達(dá)了突變的R1247A/R1283A DCAF1，該點(diǎn)突破壞了其泛素化TET2的能力。作者進(jìn)行免疫沉淀(IP)并結(jié)合進(jìn)行質(zhì)譜分析，以鑒定TET2相互作用蛋白。作者鑒定了大量TET2相互作用蛋白，其中有一種DUB，即Usp15。

????????為了證實(shí)TET2與Usp15的相互作用，通過IP-Western印跡分析，作者發(fā)現(xiàn)在Flag-TET2免疫復(fù)合物中很容易檢測(cè)到異位表達(dá)的Myc-USP15。使用識(shí)別TET2或Usp15的抗體，作者在人類U2OS細(xì)胞和小鼠B16-卵白蛋白(OVA)細(xì)胞中通過IP-Western測(cè)定檢測(cè)了Usp15和TET2之間的內(nèi)源性相互作用。接下來，作者將Usp15結(jié)合位點(diǎn)映射到TET2的C端CD結(jié)構(gòu)域。使用純化重組蛋白的體外下拉分析證明了人類Usp15和人類TET2蛋白的CD結(jié)構(gòu)域之間的直接相互作用。

研究結(jié)論：Usp15和TET2在物理上相互作用，TET2的CD域負(fù)責(zé)它們的關(guān)聯(lián)。

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2.USP15在K1299處去泛素化TET2

????為了確定Usp15是否催化TET2去泛素化，作者首先異位表達(dá)WT或催化失活突變體C269A Usp15與Flag-TET2并進(jìn)行體內(nèi)泛素化測(cè)定。WT Usp15的過表達(dá)，而不是催化失活的突變體，降低了TET2的單泛素化。接下來，作者將WT或催化失活的Usp15轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)HA-泛素的U2OS細(xì)胞中，然后對(duì)內(nèi)源性TET2進(jìn)行IP-Western分析。該實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)Usp15過表達(dá)時(shí)，內(nèi)源性TET2的單泛素化顯著降低。相反，293T和U2OS細(xì)胞中Usp15的敲低顯著增加了異位表達(dá)和內(nèi)源性TET2的單泛素化。為了確定Usp15是否在K1299（先前證明的TET2泛素化位點(diǎn)）處特異性去泛素化TET2，作者用Usp15轉(zhuǎn)染帶有Flag標(biāo)簽的WT或K1299N突變體TET2，然后進(jìn)行體內(nèi)泛素化測(cè)定。Usp15的過表達(dá)不能進(jìn)一步降低K1299單泛素化水平，表明Usp15在K1299處特異性去泛素化TET2。相反，作者證明Usp15的敲低會(huì)增加WT TET2的泛素化，但不會(huì)增加K1299N突變體TET2的泛素化。在Usp15–KO和Usp15/Tet2 DKO B16-OVA細(xì)胞中，作者發(fā)現(xiàn)Usp15的缺失顯著增加了K1212（人類中的K1299）Tet2的單泛素化。

研究結(jié)論：USP15在K1299處去泛素化TET2。

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3.USP15使TET2失活并抑制TET2與底物DNA的結(jié)合? ? ?

????????為了確定Usp15-TET2相互作用的功能意義，作者首先進(jìn)行了斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，以確定異位表達(dá)Usp15的細(xì)胞中的5hmC水平。作者發(fā)現(xiàn)WT的過表達(dá)，而不是C269A催化失活突變體Usp15，使TET活性降低了67%。用siRNA敲低Usp15使5hmC水平分別增加了41%和74%。雖然敲除B16-OVA細(xì)胞中的TET2使5hmC水平顯著降低了75%，但Usp15的缺失以TET2依賴性方式使5hmC水平增加了63%。接下來，作者使用更定量的比色測(cè)定來確定基因組中的5hmC，并獲得了相同的結(jié)果。? ? ? ?

????????此外，定量熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分析還表明，Usp15的KO增加了表達(dá)TET2的B16-OVA細(xì)胞中的TET活性。這些結(jié)果表明Usp15負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞中的TET2活性。接下來，作者檢查了Usp15是否影響TET2與其底物DNA的結(jié)合。結(jié)果表明，TET2與WT的共表達(dá)，降低了TET2 DNA結(jié)合。相反，沉默Usp15增強(qiáng)了TET2 DNA結(jié)合，表明Usp15在體外削弱了TET2與DNA的結(jié)合。

????????此外，作者從WT或Usp15 KO小鼠中分離了肝臟和骨髓，并通過抗體依賴性比色法測(cè)定了5hmC水平。作者發(fā)現(xiàn)Usp15的KO增加了肝臟和骨髓中的TET活性。總之，這些結(jié)果表明Usp15在體內(nèi)抑制TET與DNA的結(jié)合和TET活性。

研究結(jié)論：USP15使TET2失活并抑制TET2與底物DNA的結(jié)合。

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4.Usp15和TET2反向調(diào)節(jié)參與多種炎癥過程的基因

????????作者接下來探究Usp15是否可以改變TET2靶基因的表達(dá)。作者之前報(bào)道了TET2在介導(dǎo)IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)中的功能。因此，作者確定了用IFN-γ處理與否的WT、Tet2和Usp15 KOB16黑色素瘤細(xì)胞中的基因表達(dá)。在IFN-γ處理后，總共有1197個(gè)基因被誘導(dǎo)高表達(dá)。在這1197個(gè)基因中，33%被TET2KO下調(diào)，加強(qiáng)了TET2在介導(dǎo)IFN信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。另一方面， 45%被Usp15 KO進(jìn)一步上調(diào)，證明Usp15在IFN信號(hào)傳導(dǎo)中的重要作用。值得注意的是，181個(gè)IFN-γ誘導(dǎo)基因受到Usp15和TET2KO的反向調(diào)控。這些結(jié)果表明Usp15是TET2的主要抑制劑，Tet2是Usp15調(diào)節(jié)IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)的主要靶點(diǎn)。KEGG對(duì)這181個(gè)基因信號(hào)通路分析顯示，它們富含多種炎癥信號(hào)通路，包括腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、Toll樣受體和Janus激酶(JAK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號(hào)通路。Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11也被TET2KO下調(diào)，但它們的表達(dá)在B16細(xì)胞中被Usp15 KO上調(diào)。

研究結(jié)論：Usp15和TET2反向調(diào)節(jié)參與多種炎癥信號(hào)通路的基因的表達(dá)。

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5.Usp15的缺失促進(jìn)IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)? ? ? ?

????????為了證實(shí)Usp15負(fù)向調(diào)節(jié)IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)，作者用IFN-γ處理不同基因型的B16-OVA細(xì)胞并檢查轉(zhuǎn)錄和啟動(dòng)子甲基化。作者發(fā)現(xiàn)Usp15的缺失顯著增加了TH1型趨化因子基因Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11的mRNA水平，并且當(dāng)TET2缺失時(shí)，這些增加顯著減少，表明Usp15通過TET2介導(dǎo)對(duì)這些基因的抑制。? ? ?

????????作者通過ELISA分析，Usp15的缺失以Tet2依賴的方式增加了Cxcl9和Cxcl10對(duì)IFN-γ處理的蛋白水平。然后作者進(jìn)行了Transwell測(cè)定，作者發(fā)現(xiàn)，與在WT B16-OVA衍生的條件培養(yǎng)基(CM)中觀察到的相比，CD8+T細(xì)胞向來自IFN-γ處理的Usp15 KO培養(yǎng)物的CM的遷移加速。當(dāng)CM來源于經(jīng)IFN-γ處理的Usp15/Tet2DKO細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，這種增加的T細(xì)胞遷移在很大程度上被消除，表明Usp15在調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移對(duì)TET2上的功能依賴性。此外，將重組鼠CxcL10添加到來自TET2-KO和TET2/Usp15-DKO細(xì)胞培養(yǎng)物的CM恢復(fù)了T細(xì)胞遷移。這些結(jié)果表明Usp15缺失增加了IFN-γ誘導(dǎo)的TET2趨化因子產(chǎn)生，這直接導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞遷移增加。

????????此外，作者發(fā)現(xiàn)WT TET2的異位表達(dá)，而不是K1299N突變體，在很大程度上恢復(fù)了IFN-γ對(duì)Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11的誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明，USP15介導(dǎo)的TET2的K1299去泛素化對(duì)于IFN-γ誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)很重要。接下來，作者進(jìn)行了ChIP-qPCR分析，以確定Usp15是否影響TET2與Cxcl10啟動(dòng)子的結(jié)合。作者證實(shí)IFN-γ刺激了TET2與B16-OVA細(xì)胞中Cxcl10啟動(dòng)子的結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)Usp15的缺失增加了TET2與Cxcl10啟動(dòng)子的結(jié)合。在IFN-γ處理后，Tet2-WTB16-OVA細(xì)胞中Cxcl10啟動(dòng)子的5hmC水平增加了17倍，并且Usp15的缺失進(jìn)一步使Cxcl10啟動(dòng)子處的5hmC增加了29倍。TET2的缺失幾乎完全消除了Usp15敲低對(duì)刺激5hmC的影響。

研究結(jié)論：這些結(jié)果表明Usp15缺失增加了TET2與趨化因子基因啟動(dòng)子的結(jié)合，導(dǎo)致趨化因子基因的去甲基化和表達(dá)增加。

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6.Usp15的缺失可以增強(qiáng)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞和抗腫瘤免疫治療

????????Usp15對(duì)TET活性的負(fù)調(diào)節(jié)使作者想探究Usp15的缺失是否可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫和免疫治療效果。與親本W(wǎng)TB16-OVA細(xì)胞相比，Tet2-KOB16-OVA細(xì)胞顯示出相似的增殖率，并且Usp15 KO增加了細(xì)胞增殖，但這種增加與TET2無關(guān)。接下來，作者將等量的WT、Tet2-KO、Usp15-KO或TET2/Usp15 DKO B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞皮下移植到小鼠中，然后靜脈注射識(shí)別OVA抗原（在B16-OVA細(xì)胞）的OT-I細(xì)胞。Tet2的缺失顯著將移植了WTB16-OVA細(xì)胞的小鼠的平均壽命從28天減少到20天。相比之下，Usp15的缺失顯著將移植了WTB16-OVA細(xì)胞的小鼠的平均壽命從28天延長至35天以上。接下來，作者確定了Usp15缺失對(duì)抗PD-L1免疫療法的影響。移植Usp15-KOB16-OVA細(xì)胞的小鼠的平均壽命比移植WT細(xì)胞的小鼠顯著延長。與移植了TET2-KO細(xì)胞（20.5天）的小鼠相比，移植了TET2/Usp15 DKO細(xì)胞（24.5天）的小鼠的平均壽命也增加了16.3%，但Usp15缺失賦予了壽命的延長在TET2存在下更明顯。另一方面，Usp15缺失導(dǎo)致腫瘤浸潤C(jī)D8+和CD3+T細(xì)胞的增加，并且它們的增加取決于兩種模型中TET2的表達(dá)。最后，作者檢查了腫瘤內(nèi)趨化因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雖然Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11表達(dá)在TET2-KOB16-OVA腫瘤中顯著降低，但它們?cè)赨sp15-KO腫瘤中的表達(dá)以Cxc依賴性方式增加。

研究結(jié)論：腫瘤中Usp15的缺失刺激趨化因子表達(dá)和淋巴細(xì)胞浸潤，并增強(qiáng)抗腫瘤免疫的效果和抗PD-L1免疫療法的療效。

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結(jié)論與討論

????????腫瘤細(xì)胞中Usp15的缺失促進(jìn)了腫瘤內(nèi)趨化因子的產(chǎn)生和T細(xì)胞的腫瘤浸潤，增強(qiáng)了對(duì)T細(xì)胞免疫和抗PD-L1治療的反應(yīng)，從而延長了腫瘤小鼠的壽命。這些發(fā)現(xiàn)表明Usp15是增強(qiáng)實(shí)體瘤抗腫瘤免疫和免疫治療功效的潛在治療靶點(diǎn)。此外， Usp15缺陷促進(jìn)T細(xì)胞活化并增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)體內(nèi)腫瘤免疫的反應(yīng)。作者認(rèn)為開發(fā)USP15的抑制劑，可以通過增強(qiáng)腫瘤內(nèi)在TET活性和趨化因子產(chǎn)生以及T細(xì)胞內(nèi)在活性和IFN-y產(chǎn)生來特異性和有效地促進(jìn)免疫治療，并且毒性小。

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Thank you!

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原文鏈接:https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abc9730