ClusterProfiler在線基因集富集分析，支持自定義基因集、任意物種
為什么pathway富集分析結(jié)果沒(méi)有我感興趣的通路？
GO和KEGG富集分析使用差異基因（上調(diào)基因，下調(diào)基因，或者上下調(diào)合起來(lái)的基因）作為輸入，使用超幾何分布等算法計(jì)算顯著富集的GO term或者通路，然而，在實(shí)際數(shù)據(jù)處理中，這種使用p值和fold change進(jìn)行一刀切獲得差異基因，然后進(jìn)行富集分析的分析方法，往往富集不到我們感興趣的結(jié)果。這時(shí)，可以試試基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA），它使用全部基因作為輸入，找出具有協(xié)同差異 (concordant differences)的基因集，兼顧了差異較小的基因（因?yàn)樵谀承l件下，1.5倍的差異可能就算很大的了）。因此，Broad institute出品的GSEA在論文中應(yīng)用廣泛。
圖1 GSEA原理（圖片來(lái)自plob.org）
GSEA分析原理
1，基因排序：
利用所有基因的表達(dá)值，計(jì)算每個(gè)基因在兩個(gè)表型（ClassA和ClassB）間的差異程度（GSEA提供了6種算法，默認(rèn)是signal2ratio），然后按照差異程度將基因從大到小排序。這里差異是有正有負(fù)的，正值越大表示在ClassA (vs ClassB)中表達(dá)越高，越負(fù)表示在ClassA中表達(dá)越低。
2，分析基因集是否富集：基因集（gene set）是一類具有相關(guān)功能（例如免疫相關(guān)）或者符合某一標(biāo)準(zhǔn)（例如某個(gè)miRNA的200個(gè)靶基因）的基因構(gòu)成的一組基因。圖中GeneSet1（一個(gè)箭頭代表一個(gè)基因）里的基因在排序的基因列表里均勻分布（表明這個(gè)基因集不在這兩個(gè)表型中富集），GeneSet2里的基因主要分布在基因列表的頂部（表明在ClassA中富集），GeneSet3里面的基因主要分布在基因列表的底部（表明在ClassB中富集）。3，計(jì)算富集分?jǐn)?shù)：計(jì)算每個(gè)基因集的富集分?jǐn)?shù)（enrichment score，ES），然后對(duì)ES分?jǐn)?shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及多重假設(shè)檢驗(yàn)，從而計(jì)算出顯著富集的基因集。
常見的GSEA分析軟件及評(píng)測(cè)：
目前常見的gsea分析軟件包括：
官方Broad的GSEA；
R版的fgsea，clusterprofiler；
Python版的GSEApy等
Broad GSEA軟件分析的兩種模式1，常規(guī)模式：輸入表達(dá)矩陣，軟件自動(dòng)計(jì)算foldchange，由于要進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，因此至少3vs3。2，Prerank模式：輸入排序后的基因列表，針對(duì)那些例如1vs1這種不能用常規(guī)模式計(jì)算的數(shù)據(jù)。我們使用同一套數(shù)據(jù)集測(cè)試了Broad GSEA prerank模式，ClusterProfiler，GSEApy發(fā)現(xiàn)：
1，Broad GSEA最慢，ClusterProfiler最快，算法不太一樣
基于以上測(cè)試結(jié)果，經(jīng)過(guò)權(quán)衡，我們上線了基于ClusterProfiler的基因集富集分析頁(yè)面。
圖2. GSEA輸出示例
1 ， 1，打開GSEA分析和繪圖頁(yè)面
首先，使用瀏覽器（推薦chrome或者edge）打開GSEA分析和繪圖頁(yè)面。左側(cè)為常見作圖導(dǎo)航，中間為數(shù)據(jù)輸入框和可選參數(shù)，右側(cè)為描述和結(jié)果示例。也可以在主頁(yè)搜索框中搜索gsea，找到gsea分析和繪圖頁(yè)面。
https://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_gene_set_enrichment_analysis_gsea_analysis_193
圖3.GSEA分析頁(yè)面
2，示例數(shù)據(jù)
點(diǎn)擊右側(cè)“示例數(shù)據(jù)”鏈接下載excel格式的示例數(shù)據(jù)。
圖4. 輸入數(shù)據(jù)示例
示例數(shù)據(jù)（僅供參考）包括2列：
第1列是基因名（symbol）
第2列是倍數(shù)變化（從大到小排列，正的在頂部，負(fù)的在底部）
注意：這里是全部的基因（例如人的約2w個(gè)基因）
3，粘貼示例數(shù)據(jù)
直接復(fù)制示例數(shù)據(jù)中的AB兩列數(shù)據(jù)，然后粘貼到輸入框。
注意：不是拷貝excel文件，是拷貝excel文件里邊的數(shù)據(jù)。另外粘貼到輸入框后，格式亂了沒(méi)關(guān)系，只要在excel中是整齊的就行。并且數(shù)據(jù)矩陣中不能有空的單元格，中文字符等。
圖5. 必需輸入
4，修改參數(shù)，并提交
我們?cè)O(shè)置了圖片尺寸，文字大小，顏色等參數(shù)，并內(nèi)置了GSEA官網(wǎng)（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）的多個(gè)基因集，包括最常用的：hallmark基因集，kegg基因集等（這些基因集僅支持human）
圖6.可調(diào)參數(shù)
5，提交分析
粘貼好輸入數(shù)據(jù)，調(diào)整好參數(shù)（或者全部默認(rèn)）后，點(diǎn)擊提交按鈕，約15秒后，會(huì)在頁(yè)面右側(cè)出現(xiàn)富集結(jié)果預(yù)覽圖和分析結(jié)果。我們提供了4種圖片格式供下載使用，兩種矢量圖（pdf，svg）和兩種標(biāo)量圖（600 dpi tiff和300 dpi png）。
圖7.預(yù)覽與下載
結(jié)果解析
該圖分為3塊：
最上方：Enrichment Score折線圖。橫坐標(biāo)是排序后的基因，縱坐標(biāo)是對(duì)應(yīng)的Running ES, 折線的峰值是這個(gè)基因集的富集分?jǐn)?shù)（Enrichment Score，ES）。正值說(shuō)明在ClassA中富集，峰值左邊的基因?yàn)楹诵幕?，?fù)值相反（見原理）
中間：基因集中基因在基因排序列表中所處的位置，也就是將圖1中的三個(gè)垂直數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)動(dòng)了90度擺放。如果所研究的基因集中的基因顯著聚集在左側(cè)，則說(shuō)明該基因集與ClassA相關(guān)，顯著富集在右側(cè)，說(shuō)明與ClassB相關(guān)。
下方：每個(gè)基因?qū)?yīng)的ranked list metric，以灰色面積圖展示。
結(jié)果文件如下：
圖8. Gsea分析結(jié)果
各列說(shuō)明：
Geneset, ID，Description：基因集名字及描述
SetSize：富集到該基因集的基因個(gè)數(shù)
Enrichment score：富集分?jǐn)?shù)ES
NES：標(biāo)準(zhǔn)化的ES，normalized enrichment score
Pvalue：富集的p值
p.adjust：校正p值
qvalues：qvalue
rank：排名
core_enrichment：富集到該通路的核心基因列表
一般來(lái)說(shuō)：NES絕對(duì)值越大，F(xiàn)DR值越小，說(shuō)明富集程度越高，結(jié)果越可靠。
重點(diǎn)來(lái)了，自定義數(shù)據(jù)集
常規(guī)的GSEA僅支持human物種，因此在對(duì)非human物種進(jìn)行GSEA分析時(shí)，我們首先需要定義一個(gè)基因集，這個(gè)基因集可以來(lái)自文獻(xiàn)，數(shù)據(jù)庫(kù)等。以細(xì)胞焦亡、銅死亡、鐵死亡等基因集為例，首先選擇自定義基因集按鈕，然后將相關(guān)基因按照自定義基因集示例格式貼到自定義輸入框：
一行一個(gè)基因集。第一列是名字，第二列是來(lái)源，后續(xù)列為該基因集里邊的基因，盡量避免使用特殊符號(hào)，并且這些基因名必需在你輸入的全部基因里。
圖9. 自定義基因集
點(diǎn)擊提交按鈕，約15s后，會(huì)在右側(cè)出現(xiàn)自定義基因集的富集結(jié)果。
圖10. 自定義基因集輸出結(jié)果
想看你的數(shù)據(jù)是否跟最新的銅死亡，鐵死亡，鋅死亡，細(xì)胞焦亡等熱點(diǎn)相關(guān)，可以先拿這些基因集跑個(gè)GSEA試試看，這就是自定義基因集的強(qiáng)大之處。
沒(méi)有預(yù)覽就是沒(méi)有出圖，這時(shí)請(qǐng)參考示例數(shù)據(jù)，檢查自己輸入數(shù)據(jù)的格式。
遇到文字截?cái)?，需要修改字體、調(diào)整字體大小等，使用scape軟件。
微生信助力發(fā)文章，谷歌引用600+，知網(wǎng)引用450+
