鎘（Cd）被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為I類人類肺癌致癌物，主要通過香煙煙霧表面擴散，有大量研究表明在肺癌的發(fā)展過程中circRNAs異常表達現(xiàn)象普遍存在，導(dǎo)致多種信號通路的激活，可能通過影響細胞功能發(fā)揮致癌或抗癌作用。

DNA堿基切除修復(fù)（BER）是一種高度保守的DNA損傷修復(fù)途徑，對于不同類型的內(nèi)源性和外源性DNA堿基損傷的修復(fù)至關(guān)重要。已有研究證明APEX1和XRCC1參與DNA損傷部位的損傷識別和堿基修復(fù)。基于circRNAs和DNA損傷的重要，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的蔣義國教授帶領(lǐng)的研究團隊猜測circRNAs可能通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)在Cd誘導(dǎo)的肺癌中發(fā)揮作用。

2023年2月，蔣義國的研究團隊在《ADVANCED SCIENCE》期刊發(fā)表題為“circCIMT Silencing Promotes Cadmium-Induced Malignant Transformation of Lung Epithelial Cells Through the DNA Base Excision Repair Pathway（circCIMT沉默通過DNA堿基切除修復(fù)途徑促進鎘誘導(dǎo)的肺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化）”的研究論文。研究證明了circCIMT與APEX1相互作用，通過BER通路抑制DNA損傷，強調(diào)了表觀遺傳學(xué)在Cd誘導(dǎo)的肺癌中介導(dǎo)遺傳損傷的作用。值得一提的是，該研究中使用了漢恒生物提供的用于沉默circCIMT和APEX1的慢病毒感染肺上皮細胞，以此來研究circCIMT和APEX1在肺癌發(fā)展過程中的作用。

首先，作者建立了小鼠慢性Cd接觸模型，根據(jù)人體實時接觸數(shù)據(jù)，讓小鼠通過口鼻吸入等效實時接觸濃度（0.640mg·m-3）的Cd 。Cd接觸45周后，在小鼠血清中檢測到高濃度的Cd（圖1B），病理檢查顯示肺組織中出現(xiàn)大面積大核細胞、大面積嗜堿性細胞和異常增生（圖1A）。另外，癌癥干細胞（CSCs）的分子標志物Aldh1a1和Sox2的表達水平顯著升高（圖1C,D），腫瘤體積和重量明顯大于對照組（圖1I-K）。另外，作者還使用正常支氣管上皮細胞株BEAS-2B和16HBE構(gòu)建了體外cd誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化模型。通過估計接觸香煙1年的人血液中Cd的累積濃度，最終選擇低濃度（1 μM和10 μM）以研究慢性低劑量照射對細胞轉(zhuǎn)化的影響。將BEAS-2B和16HBE細胞分別暴露于1 μM和10 μM Cd下，連續(xù)65周，實驗結(jié)果顯示Cd處理的細胞的增殖和遷移能力增強，侵襲增加，軟瓊脂克隆形成實驗表明細胞克隆形成能力增強并且可形成球體（圖1E-H）。體內(nèi)和體外實驗結(jié)果表明，長期接觸低濃度Cd中會促進小鼠肺支氣管上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化和惡性病變。

圖1慢性低劑量鎘暴露可導(dǎo)致小鼠肺部惡性病變和支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化

接著作者試圖探索circRNA在Cd誘導(dǎo)的肺癌中的作用，通過對接觸Cd 10周后的BEAS-2B細胞進行全轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)novel_circ_004401（circCIMT）下調(diào)最為顯著。通過檢測肺癌患者體內(nèi)以及注射Cd后的小鼠體內(nèi)的Cd和circCIMT水平，發(fā)現(xiàn)circCIMT與Cd濃度呈負相關(guān)（圖2A-E）。作者構(gòu)建了circCIMT的干擾和過表達模型進一步研究circCIMT的作用，發(fā)現(xiàn)circCIM沉默后，Cd處理的BEAS-2B細胞的遷移和侵襲能力增強，提高了Cd處理的BEAS-2B細胞的擴增能力，軟瓊脂克隆形成實驗表明細胞克隆形成能力增強，而circCIMT過表達則具有相反的效果（圖2I-M）。以上實驗結(jié)果表明circCIMT負向調(diào)節(jié)Cd處理的細胞的生長。

圖2 circCIMT在Cd誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化模型中的表達和功能

作者通過基因富集分析接觸Cd 10周的BEAS-2B細胞發(fā)現(xiàn)DNA損傷反應(yīng)基因γ-H2AX表達水平增加，彗星實驗中DNA的橄欖尾矩（OTM）增加，表明接觸Cd會導(dǎo)致DNA損傷。因此，作者試圖確定circCIMT在Cd誘導(dǎo)的DNA損傷中的作用以研究circCIMT在Cd誘導(dǎo)的肺癌轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用的機制。作者設(shè)置了實驗組BEAS-2B細胞（接觸Cd）和對照組（不接觸Cd），分別敲低和過表達circCIMT，發(fā)現(xiàn)對照組敲低和過表達circCIMT前后沒有變化，而實驗組中沉默circCIMT可以觀察到γ-H2AX表達水平增加，OTM增加，過表達circCIMT則相反，表明circCIMT可以抑制暴露于Cd時肺上皮細胞的DNA損傷。

而circCIMT是如何介導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)的呢？RNA Pull-Down實驗發(fā)現(xiàn)參與DNA損傷修復(fù)的蛋白APEX1富集在circCIMT下拉蛋白復(fù)合物中（圖3A,B），由此猜測circCIMT通過APEX1影響DNA損傷。作者發(fā)現(xiàn)，小鼠停止吸入Cd后，肺組織中的APEX1表達水平顯著下降，其表達水平與circCIMT的表達呈正相關(guān)（圖3D,E）。敲低APEX1導(dǎo)致細胞接觸Cd期間γ-H2AX表達增加，而過表達APEX1則相反（圖3F,G）。當細胞接觸Cd時，同時敲低circCIMT和APEX1比單獨敲低circCIMT或APEX1的DNA損傷更嚴重（圖3I）。由此可得，APEX1是circCIMT調(diào)控DNA損傷的關(guān)鍵分子。

圖3 circCIMT與APEX1相互作用抑制DNA損傷

APEX1是一種核酸內(nèi)切酶，參與DNA損傷部位的損傷識別和堿基修復(fù)，已得出APEX1是circCIMT調(diào)控DNA損傷的關(guān)鍵分子，所以作者接著研究了circCIMT和BER蛋白在Cd誘導(dǎo)過程中的調(diào)控關(guān)系。Cd暴露期間，細胞中BER蛋白（如XRCC1、PARP1和LIG3）表達水平均下降，表明Cd暴露損害BER通路，而過表達circCIMT后BER復(fù)合蛋白的表達顯著增加，同時γ-H2AX的表達降低（圖4A-C），敲低circCIMT則抑制BER復(fù)合蛋白的表達（圖4D-F）。免疫熒光染色顯示APEX1、XRCC1、PARP1和LIG3主要在細胞核中表達（圖4G），分離細胞核和細胞質(zhì)蛋白，發(fā)現(xiàn)敲低circCIMT導(dǎo)致細胞核中BER通路蛋白顯著減少，而對細胞質(zhì)中的這些蛋白表達水平無顯著影響（圖4I）。這些實驗結(jié)果表明，circCIMT干擾通過降低核BER通路蛋白的表達來抑制DNA損傷反應(yīng)。

圖4 circcimt干擾抑制Cd暴露后核堿基切除修復(fù)（BER）復(fù)合蛋白的表達。

KEGG富集分析散點圖顯示多個基因與CSC相關(guān)通路相交，包括Gsk3b、Notch2、Pik3cb、Myc、Cdkn1a和Smad3，在人類樣本的肺癌組織中也觀察到了Pik3cb、Myc和Cdkn1a的高表達（圖5A,B）。作者在持續(xù)接觸Cd的細胞中同時敲低circCIMT和APEX1，發(fā)現(xiàn)CSC相關(guān)通路基因（Pik3cb、Myc、Cdkn1a和Smad3）穩(wěn)定上調(diào)（圖5C-F），持續(xù)基礎(chǔ)15周后，細胞增殖水平增加（圖5G），接觸20周時，軟瓊脂克隆形成實驗表明細胞克隆形成能力增強（圖5H），異種移植小鼠模型結(jié)果顯示同時敲低circCIMT和APEX1促進Cd誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化和細胞生長（圖5I-K）。以上結(jié)果均表明，在接觸Cd的細胞中，circ CIMT和APEX1的下調(diào)不僅促進了腫瘤相關(guān)基因的表達，而且顯著縮短了細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的時間。

圖5同時敲低circCIMT和APEX1促進腫瘤相關(guān)基因的表達和細胞的惡性轉(zhuǎn)化

綜上，該研究闡明了circCIMT在鎘誘導(dǎo)的肺癌中的作用，circCIMT通過與APEX1結(jié)合，介導(dǎo)DNA堿基切除修復(fù)通路減少DNA損傷，從而抑制鎘轉(zhuǎn)化細胞的遷移和侵襲能力，證實了circCIMT通過調(diào)節(jié)DNA損傷影響化學(xué)致癌的發(fā)生，提供了circCIMT作為Cd誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)因子的表觀遺傳學(xué)證據(jù)，為識別肺癌中的關(guān)鍵遺傳-表觀遺傳-環(huán)境相互作用提供了新的見解。

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（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36814305/）