一、?實驗目的：?通過染色質(zhì)免疫沉淀的方式：用HIF1A抗體共沉淀樣本中HIF1A蛋白及與其互作DNA；然后回收純化 DNA, qPCR進行分析，驗證該轉(zhuǎn)錄因子是否與啟動子結(jié)合及結(jié)合位置。

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二、實驗材料

l?主要試劑

l?主要儀器及器材

三、實驗步驟

1. 組織交聯(lián)：

a.取1g組織，在液氮中將材料充分研磨；將研磨粉末加入到裝有10mlPBS的離心管中，渦旋振蕩混勻；

b.?加270ul 37%甲醛（終濃度為1%）進行交聯(lián)，搖床孵育10min；

c.?加入500ul?2.5M甘氨酸（終濃度為0.125M）終止交聯(lián)，搖床孵育5min。

d.?3000g，4°，離心5min，用預冷的1X PBS（10ml）清洗2次，每次用3000g，4°，5min離心。（此樣本沉淀可凍存于-80°）

2. 胞核制備和染色質(zhì)碎裂：

a.?將一（e）中的樣品在冰上孵育10min，（3000g，4°，5min）離心，棄上清；

b.?再用1ml cell swell buffer(1X)重懸，在冰上孵育10min，（5000g，4°，5min）離心，棄上清。；

c.?用200ul SDS lysis buffer重懸，冰上裂解30min，并用槍頭吹打;

d.?再加入800ul CHIP dilution buffer（IP buffer）以稀釋SDS，進行超聲;(?JY92-IIN:30%功率，2s on，24s off，總長5min；間隔3min,重復超聲6次)

e.?取30ul超聲后的染色質(zhì)樣品，加入120ul 無酶水、6ul 5M NaCl、2μl RNAse A（10mg/ml）。渦旋混合，并在 37℃ 下孵育樣品 30 分鐘;

f.?再加入2 μl Proteinase K（20mg/ml），65℃ 下孵育樣品過夜;

g.?純化 DNA;并電泳確認片段主帶是否在200~500bp（若片段過長，則增加打斷時間繼續(xù)優(yōu)化片段化條件）

3. 抗體結(jié)合反應：

a.取40ul作為10%的INPUT，于-80℃凍存?zhèn)溆?；?00ul加入目的抗體作為IP組，另取一管400ul加入IgG作為IgG做，4°旋轉(zhuǎn)孵育過夜；

b.?每個樣品取20ul ProteinA/G磁珠，用1ml IP buffer洗滌，置于磁力架上，棄上清

c.?重復上步驟一次；

d.?把洗滌好的磁珠加入到過夜孵育的抗體-蛋白混合物中，4°旋轉(zhuǎn)孵育2h；

e.?將樣品置于磁力架上，棄上清。用1 ml 低鹽洗滌液到微珠中進行洗滌，4°C 下旋轉(zhuǎn)孵育 5 分鐘。再重復洗滌兩次，以確?？偣策M行 3 次低鹽洗滌。；

f.?將樣品置于磁力架上，棄上清;用1 ml 高鹽洗滌液到微珠中進行洗滌，4°C 下旋轉(zhuǎn)孵育 5 分鐘；

g.?將樣品置于磁力架上，棄上清;用1 ml LiCl洗滌液到微珠中進行洗滌，4°C 下旋轉(zhuǎn)孵育 5 分鐘；

h.?將樣品置于磁力架上，棄上清。用1 ml TE緩沖液到微珠中進行洗滌, 將樣品置于磁力架上，棄上清；

i.?向每份 IP 樣品中添加 150 μl ChIP 洗脫緩沖液；

j.??65°C下孵育30min，并不時震蕩，將染色質(zhì)從Beads 上洗脫下來;

k.?短暫離心收集液體于管底，將樣品置于磁力架上，收集上清液于新的EP管中；

l.?取出INPUT，添加IP buffer至150ul；

m.?向所有樣品中（包括INPUT），加入6ul 5M NaCl、2μl RNAse A（10mg/ml）。渦旋混合，并在 37℃ 下孵育樣品 30 分鐘。;

n.?加入2 μl Proteinase K（20mg/ml），65℃ 下孵育樣品過夜;

o.?使用 DNA 純化離心柱從樣品中純化 DNA;

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2. qPCR檢測：

a. 將Mix在4℃下融解，輕柔地上下顛倒混勻并進行短暫離心。

b. 冰上配制下表中的反應液

c. 將反應管進行短暫離心，確保所有反應液在反應孔底部。

d. 采用三步法程序進行反應：

3.實驗結(jié)果：

a.抗體驗證結(jié)果：

b.?CHIP-qPCR柱狀圖及PCR產(chǎn)物電泳圖：

c.CHIP片段化圖：

4、項目內(nèi)容

廣州如期生物技術有限公司成立于2016年，始終以探索科學、服務客戶為己任；致力于為高校、科研院所、醫(yī)院、制藥企業(yè)提供全面、便捷、專業(yè)的技術服務和產(chǎn)品。技術方面我們專注于生物醫(yī)學領域：公司擁有完善的技術服務平臺，覆蓋分子生物學，轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學、蛋白組學，表觀遺傳等多個科研平臺。在產(chǎn)品方面，自主研究多種類型科研試劑盒20多項，如：COIP、CHIP、RIP等科研檢測試劑盒，較之同類型的進口試劑盒，極大的降低了科研成本。

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