2023年5月，由Hitomi Takada為第一作者，Akira Kurisaki為通訊作者，在《nature?communications》發(fā)表了題為《Single-cell transcriptomics uncovers EGFR signaling-mediated gastric progenitor cell differentiation in stomach homeostasis》的文章，該文章創(chuàng)新性的證實(shí)了EGFR信號(hào)在正常胃穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的是促進(jìn)分化的功能，而不是有絲分裂的功能。

首先，作者探究了祖細(xì)胞向隱窩細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)控途徑，作者使用FatelD算法進(jìn)行分析數(shù)據(jù)，其中一種主要細(xì)胞標(biāo)記物Pgc在大多數(shù)胃上皮細(xì)胞中mRNA水平均有較高的表達(dá)，如先前報(bào)道，從成熟的隱窩細(xì)胞到胃主要細(xì)胞的表達(dá)水平逐漸增加。但有趣的是，在觀察到Pgc表達(dá)的情況下，隱窩細(xì)胞、祖細(xì)胞和頸細(xì)胞呈現(xiàn)連續(xù)的分化狀態(tài)，而壁細(xì)胞被認(rèn)為是孤立的集群。

從祖細(xì)胞到隱窩細(xì)胞分化的表達(dá)譜共鑒定出47個(gè)基因共表達(dá)節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的分層聚類確定了兩個(gè)主要群體。從祖細(xì)胞到隱窩細(xì)胞表達(dá)增加的A組基因含有各種隱窩細(xì)胞標(biāo)記物，如Gkn2、Gkn1和Mucsac，而在祖細(xì)胞中高表達(dá)的B組基因含有已知的祖細(xì)胞標(biāo)記物，如Mki67、Pcna和Stmn1。隱窩細(xì)胞相關(guān)的A組除了先前報(bào)道的隱窩細(xì)胞分化相關(guān)的TF KLF431外，還含有FOXA3、PPARG、TCF23等轉(zhuǎn)錄因子。相比之下，祖細(xì)胞相關(guān)的B組含有DNMT1、CEBPB、FOXM1和HMGAL，它們的表達(dá)與增生性胃癌相關(guān)。

作者使用g:Profiler對A組基因進(jìn)行分析，確定了與隱窩細(xì)胞分化相關(guān)的調(diào)控途徑，包括整合素、EGFR和MAPK信號(hào)通路等。B組基因涉及的通路與細(xì)胞周期和增殖有關(guān)，與祖細(xì)胞的高增殖狀態(tài)一致。此外，TNF-α/NF-kB信號(hào)通路和蛋白酶體降解途徑在B組基因中表達(dá)。值得注意的是，EGFR信號(hào)和TNF-α/NF-kB信號(hào)分別在隱窩細(xì)胞相關(guān)組A和祖細(xì)胞相關(guān)組B中表達(dá)。（圖1）

配體-受體表達(dá)譜強(qiáng)烈提示TGFα-EGFR信號(hào)通路參與了隱窩細(xì)胞分化。因此，作者接下來利用一個(gè)完善的胃類器官系統(tǒng)來研究這種信號(hào)傳導(dǎo)對隱窩細(xì)胞分化的影響。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，類器官中大約一半的細(xì)胞是MK167增殖祖細(xì)胞，其他細(xì)胞是弱表達(dá)GKN2的未成熟的隱窩前細(xì)胞。因此，隨后的分析主要集中在隱窩細(xì)胞，標(biāo)記Muc5ac、Gkn2和Aqp3；以及祖細(xì)胞標(biāo)記Mki67的表達(dá)。此外，作者分析了Sox9和Pgc的表達(dá)，其表達(dá)水平從隱窩細(xì)胞到頸細(xì)胞逐漸增加。

在隱窩細(xì)胞分化過程中，TNF-NF-кB信號(hào)下調(diào)，提示TNF-NF-кB信號(hào)可能調(diào)控祖細(xì)胞。先前的研究報(bào)道了Iккβ/NF-кB信號(hào)在幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死中起抑制作用。然而，NF-кB信號(hào)在體內(nèi)的作用仍然難以捉摸。作者通過CellChat進(jìn)行的配體-受體分析，發(fā)現(xiàn)TNFSF12-TNFRSF12a是祖細(xì)胞中主要的TNF信號(hào)驅(qū)動(dòng)因子之一，我們用該配體處理胃類器官。TNFSF12處理后強(qiáng)烈誘導(dǎo)Mki67、Sox9和Pgc的表達(dá)。下調(diào)隱窩細(xì)胞標(biāo)記物后，經(jīng)免疫熒光染色證實(shí)，在TNFSF12處理的胃類器官中，MKI67、SOX9和NF-KB的表達(dá)增加，但GKN2蛋白的表達(dá)沒有明顯變化。值得注意的是，TNFSF12處理的胃類器官中，大多數(shù)SOX9t細(xì)胞為MK167高表達(dá)，提示TNFSF12在維持MKI67/SOX9前體細(xì)胞中的作用（圖2）。

作者進(jìn)一步探索了參與隱窩細(xì)胞分化的EGFR信號(hào)的下游效應(yīng)因子。結(jié)果顯示，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相關(guān)基因，包括ARP2/3復(fù)合物亞基(Aprclad Arpclb, Arpc2, Arpc3, Arpc4和Arpc5)的表達(dá)在隱窩細(xì)胞分化過程中上調(diào)。與此一致的是，ARP2/3抑制劑CK666完全阻斷了細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，即使在用TGFα處理后也是如此。有趣的是，CK666下調(diào)了隱窩細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，上調(diào)了Mki67和Sox9的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，ARP2/ 3介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織參與了隱窩細(xì)胞分化過程中的形態(tài)變化，并可能參與了基因表達(dá)。

MAPK信號(hào)通路中也富含隱窩細(xì)胞分化相關(guān)基因。為了研究MAPK通路是否是TGFα介導(dǎo)的隱窩細(xì)胞分化的一個(gè)下游通路，作者在TGFα存在的情況下用ERK和MEK抑制劑處理胃類器官。ERK抑制劑SCH772984完全抑制了隱窩細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，恢復(fù)了Mki67和Sox9的表達(dá)。MEK抑制劑PDO325901也抑制TGFα介導(dǎo)的基因表達(dá)變化。免疫熒光染色證實(shí)PDO325901抑制TGFα誘導(dǎo)的胃類器官中ERK的磷酸化。在TGFα存在的情況下，用Stattic阻斷EGFR的另一個(gè)下游組分STAT3并不影響隱窩細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，這表明ERK是體外TGFα-EGFR介導(dǎo)的隱窩細(xì)胞分化的主要下游效應(yīng)物之一（圖3）。

綜上文所述，這些體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了計(jì)算機(jī)預(yù)測的胃上皮細(xì)胞分化的分子機(jī)制。EGFR信號(hào)通路促進(jìn)祖細(xì)胞向隱窩細(xì)胞分化并隨之誘導(dǎo)形態(tài)改變，NF-kB信號(hào)通路作為祖細(xì)胞維持的錨點(diǎn)。