前言

2022年11月，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所功能纖維材料開發(fā)與利用團(tuán)隊(duì)在《BMC Plant Biology》期刊發(fā)表了題為“Metagenomic and proteomic analysis of bacterial retting community and proteome profile in the degumming process of kenaf bast”的研究成果，研究分析了在漚麻過程中與紅麻韌皮纖維相關(guān)的微生物群落，以確定潛在的候選脫膠微生物。通過對(duì)收集漚麻液進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)不同漚制時(shí)間的紅麻纖維產(chǎn)量和質(zhì)量，運(yùn)用宏基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)微生物群落進(jìn)行表征。

基本信息

中文標(biāo)題：基于宏基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析紅麻脫膠過程中微生物群落與蛋白組變化規(guī)律

發(fā)表期刊：BMC Plant Biology

影響因子：5.260

作者單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所

涉及的組學(xué)研究：宏基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)

研究背景

紅麻屬錦葵科（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）一年生草本植物，是重要的韌皮纖維作物。紅麻韌皮原料除含有大量的纖維素外、還含有果膠、半纖維素和木質(zhì)素等“膠質(zhì)”成分。為了獲得高質(zhì)量的紡織纖維原料，必須通過“脫膠”去除非纖維素物質(zhì)。在崇尚“綠色、環(huán)?！钡慕裉?，紅麻生物脫膠備受青睞。迄今為止，紅麻脫膠的微生物群落和功能蛋白尚不清楚。此外，對(duì)功能微生物的篩選和遺傳構(gòu)建也缺乏理論依據(jù)。已有的研究主要集中在可培養(yǎng)過程中的芽孢桿菌、梭狀芽胞桿菌、梭狀芽胞桿菌和假單胞菌等。

本研究已確定了脫膠生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢細(xì)菌，包括梭狀芽孢桿菌、假單胞菌等細(xì)菌。一些細(xì)菌，特別是芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬的成員，已被證明可以產(chǎn)生果膠酶。這些細(xì)菌的存在加速了脫膠過程。因此，鑒定與非纖維素降解酶（如：果膠酶等）相關(guān)的微生物可能對(duì)紅麻脫膠過程有重要意義。

研究思路

研究結(jié)果

1.漚麻液的物理化學(xué)特性

發(fā)酵液和還原糖的pH值表征了發(fā)酵液過程中的生物發(fā)酵環(huán)境。pH值是影響微生物生長和脫膠酶活性的重要因素，一般理想的pH范圍在6.5~8.0之間。隨著漚麻時(shí)間的延長，漚麻液的pH值逐漸下降，10天后達(dá)到最低值（pH 6.4），此后pH持續(xù)升高，直到漚制34天，pH為7.3（圖1）。與pH趨勢一樣，紅麻發(fā)酵液中還原糖的含量在發(fā)酵早期（前10天）持續(xù)下降，然后逐漸增加（圖1）。綜上所述，在漚麻過程中，pH和還原糖含量的變化趨勢呈現(xiàn)為“V”形。

圖1 | pH值的變化及還原糖含量

2.紅麻纖維的形態(tài)和產(chǎn)量

通過對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的出現(xiàn)進(jìn)行定性分析。數(shù)據(jù)表明，隨著漚麻時(shí)間的增加，紅麻纖維的柔軟度、分散度和纖維白度顯著提高（圖2A），說明漚麻時(shí)間的增加增強(qiáng)了脫膠效果。掃描電鏡（SEM）可以清楚清晰地評(píng)估纖維表面形貌。掃描電鏡結(jié)果表明，紅麻纖維在發(fā)酵10天后被部分降解并開始分散。34天后，纖維完全分散，表面更平滑（圖2B)。紅麻纖維得率為63.9%。

圖2 | 不同吸液時(shí)間的外觀形態(tài)和纖維形態(tài)

3.宏基因測序分析

對(duì)原始序列分類分別為185個(gè)門、170個(gè)綱、352個(gè)目、795個(gè)科、3407個(gè)屬。在門水平上，樣品中最豐富的門是擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。在基線和早期階段，擬桿菌門的相對(duì)豐度沒有顯著差異。然而，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，擬桿菌門菌的豐度大大降低（圖3A）。相反，變形菌門的豐度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加（圖3A）。與變形菌門相似，纖維桿菌隨著吸液時(shí)間的延長而增加（圖3A）。

在屬水平上，普雷沃氏菌是最占優(yōu)勢的細(xì)菌。普雷沃氏菌在0d和10d的相對(duì)豐度約為55%，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)下降到21.27%（圖3B）。此外，結(jié)果顯示，不動(dòng)桿菌的相對(duì)豐度從基線時(shí)的2.88%增加到第34d時(shí)的6.64%（圖3B）。在漚麻階段，梭狀芽孢桿菌的一些成員從基線時(shí)的3%減少到脫膠后34d時(shí)的2%（圖3B）。然而，其他幾種平均豐度大于1%的細(xì)菌在各組間沒有顯著差異。

圖3 | 樣品中細(xì)菌的相對(duì)豐度

4.碳水化合物活性酶的分析

為了鑒定樣品中的碳水化合物活性酶，作者將從微生物群落中鑒定出的蛋白質(zhì)與CAZy數(shù)據(jù)庫的整個(gè)非冗余序列進(jìn)行了相似性搜索（圖4A和B）。Kruskal-Wallis數(shù)據(jù)顯示，糖苷水解酶家族（GHs）在34d中表達(dá)下調(diào)（圖4C），而輔助活性（AAs）在34d中表達(dá)上調(diào)。苯醌還原酶、纖維二糖脫氫酶、葡萄糖1-氧化酶、芳醇氧化酶和醇氧化酶是發(fā)酵液中最豐富的酶。這些觀察結(jié)果表明，隨著脫膠的進(jìn)行，碳水化合物的利用率不斷變化。

圖4 | 碳水化合物活性酶（CAZy）分析結(jié)果

5.蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)

PCA結(jié)果顯示，0d的樣本均位于第二象限；10d的樣本位于第四象限（第三象限的一個(gè)除外），而34d的樣本均位于第一象限。PCA顯示總方差的28.87%（PC1）和18.33%（PC2）（圖5A）。樣本間相關(guān)分析顯示，同一組樣本具有較高的相關(guān)性（圖5B）。數(shù)據(jù)表明，同一組的樣品重復(fù)性良好。

圖5 | 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

6.差異表達(dá)蛋白及功能分析

表達(dá)蛋白差異性及其功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)10d與0d比較，10d內(nèi)高表達(dá)32、24，低表達(dá)；34d，DEPs上調(diào)51，下調(diào)30；34d和10d，DEPs分別上調(diào)和下調(diào)（圖6A)。此外，作者繪制了一個(gè)熱圖來分析每次比較中DEPs的表達(dá)情況（圖6B）。

蛋白注釋信息進(jìn)一步分析DEPs，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的前5位（P37698、Q05120、P0A913、A6LEI8和B7JYG7）和下調(diào)的前5位的DEPs（P11221、Q3YUZ8、P0AY9Y8、Q97D82和P20148），倍數(shù)變化最大（圖6C）。結(jié)果表明，部分的DEPs在10d時(shí)發(fā)生了顯著變化，而其余的DEPs在34d時(shí)發(fā)生了顯著變化。此外，所有DEPs的注釋信息顯示，P82593是一種重要的半纖維素。

KEGG富集分析對(duì)10d vs. 0d和34d vs. 0d鑒定的DEPs進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，五種碳水化合物代謝相關(guān)途徑的富集。以3個(gè)DEPs、P19543、Q1ACK0和Q59199為關(guān)鍵指標(biāo)，這三個(gè)DEPs的豐度如圖6D所示。

作者還分析了不動(dòng)桿菌和梭狀芽孢桿菌中蛋白的表達(dá)。不動(dòng)桿菌的蛋白表達(dá)譜顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，B7GYR8、Q6RYW5和Q6FFK2的平均水平隨著脫膠時(shí)間的延長而降低，而P05149的平均水平上調(diào)（圖6E）。對(duì)于梭狀芽孢桿菌中的蛋白，三個(gè)脫膠相關(guān)蛋白P37698、P52040和P54937隨著取樣時(shí)間的推移而上調(diào)（圖6E）。

圖6 | 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和重要差異表達(dá)蛋白（DEPs）的表達(dá)

7.冗余分析（RDA）

作者進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了上述結(jié)果，結(jié)果表明，軟壁門、變形菌門和厚壁菌門與pH值和還原糖含量呈正相關(guān)。擬桿菌門菌與pH呈負(fù)相關(guān)（圖7A）。此外，利用RDA對(duì)上述前20個(gè)門和候選門進(jìn)行分析。結(jié)果表明，厚壁菌門與Q07637、Q6RYW5、P0DM31、Q97D82和P11221呈正相關(guān)，而與Q6FFK2呈負(fù)相關(guān)。變形菌門與P82593呈正相關(guān)（圖7B）。

圖7 | 冗余分析（RDA）排序圖

研究結(jié)論

• 不動(dòng)桿菌和梭狀芽孢桿菌可能在該紅麻脫膠過程中發(fā)揮重要作用。

• P37698、P52040、P54937和P82593蛋白的上調(diào)是脫膠過程中的重要表現(xiàn)形式，并起了重要作用。

• P82593作為一種半纖維素酶，可能在紅麻的脫膠過程中起決定性作用。

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本文首次采用宏基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合的方法，分析紅麻脫膠過程中微生物的多樣性和功能蛋白的變化。此外，還篩選了河南信陽地區(qū)脫膠微生物的優(yōu)勢微生物和差異表達(dá)蛋白。本文的研究可為篩選紅麻脫膠微生物和解析生物脫膠催化機(jī)理，提高紅麻脫膠效率和纖維質(zhì)量提供可靠依據(jù)。

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