"Cryo-EM Incites a?'Resolution Revolution,'?Rousing Drug Discovery"Copyright@Katarina Zimmer, GEN News蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析是藥物設(shè)計的關(guān)鍵。數(shù)十年來，利用X射線晶體學(xué)技術(shù)，藥物開發(fā)者們成功實現(xiàn)了大量蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析：X射線晶體學(xué)是一種利用X射線轟擊蛋白質(zhì)晶體，并對衍射出的圖案加以分析，進而還原蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)。這一技術(shù)揭示了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)前所未有的細節(jié)，有時甚至能夠達到1.2?的原子級分辨率。在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計領(lǐng)域，X射線晶體學(xué)至關(guān)重要。例如，通過對艾滋?。℉IV）蛋白酶的結(jié)構(gòu)研究，科學(xué)家們得以開發(fā)出一些能夠治療艾滋病的酶抑制藥物。然而，X射線晶體學(xué)技術(shù)有一個致命的缺點：即進行結(jié)構(gòu)解析的蛋白質(zhì)必須處于結(jié)晶狀態(tài)，而結(jié)晶是一個繁瑣的過程。此外，并不是所有的蛋白質(zhì)都能夠結(jié)晶。這時，冷凍電鏡（cryo-EM）便能夠發(fā)揮其作用。作為一項快速崛起的新技術(shù)，冷凍電鏡無須對蛋白質(zhì)結(jié)晶，便能夠完成結(jié)構(gòu)解析的流程。然而，由于技術(shù)的限制，冷凍電鏡技術(shù)的成像分辨率較低，長期以來并不被真正地看好。幸運的是，隨著時間的推移以及技術(shù)的進步，科學(xué)家們設(shè)法提高了冷凍電鏡的分辨率?；诟玫挠布退惴ǖ陌l(fā)展，在2015年左右，多項技術(shù)的突破引發(fā)了冷凍電鏡的分辨率革命。2020年，研究人員得到了去鐵蛋白的1.25 ?結(jié)構(gòu)，這表明了冷凍電鏡技術(shù)也能夠在原子細節(jié)上觀察蛋白質(zhì)。2017年的諾貝爾化學(xué)獎授予了科學(xué)家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他們在開發(fā)冷凍電鏡方面的工作，同時宣布冷凍電鏡這項技術(shù)將結(jié)構(gòu)生物學(xué)帶入了一個新時代。在制藥界中，冷凍電鏡已經(jīng)成為解析蛋白結(jié)構(gòu)的熱門工具，特別是較大蛋白如膜蛋白家族的結(jié)構(gòu)，而這恰好是X射線晶體學(xué)難以解決的領(lǐng)域：冷凍電鏡顯著擴大了基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的蛋白質(zhì)范圍。

與X射線晶體學(xué)相比，冷凍電鏡的關(guān)鍵優(yōu)勢在于蛋白質(zhì)不需要結(jié)晶，且蛋白質(zhì)只需要在純化的溶液中就能進行解析。蛋白質(zhì)樣品被急速冷凍后，電子顯微鏡利用電子束解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。然后使用計算方法將從不同角度拍攝的圖像拼接起來。進而得到蛋白質(zhì)的三維重建。利用冷凍電鏡進行基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計在如今可以實現(xiàn)更高分辨率的情況下，冷凍電鏡的應(yīng)用之一是確定靶向蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。其目的通常是在初期的藥物設(shè)計過程中或在以后的過程中仔細檢查候選藥物如何與蛋白質(zhì)結(jié)合，以更好地了解藥物和靶點的相互作用。膜蛋白和蛋白復(fù)合物是特殊的一類樣品，它們對冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析有著強烈的需求，這些蛋白通常因為太大、柔性太高，或者數(shù)量太少而無法進行結(jié)晶。她指出，冷凍電鏡的另一個優(yōu)點是它不要求蛋白質(zhì)在特定的環(huán)境中結(jié)晶，而科學(xué)家們可以利用這一優(yōu)點，獲取蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的平均分辨率在2?到2.5?之間，這一結(jié)果低于X射線晶體學(xué)的平均分辨率。不過，計算模型可以用來優(yōu)化蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)模型。然而，冷凍電鏡的最大挑戰(zhàn)在于蛋白質(zhì)樣品的制備：通常這需要將靶點與其他分子結(jié)合起來，例如，柔性較高的蛋白質(zhì)可能需要被加以穩(wěn)定。經(jīng)過恰當?shù)貥悠诽幚砗?，冷凍電鏡可以用于所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析。冷凍電鏡與基于片段的藥物設(shè)計相遇總部位于英國劍橋的Astex制藥公司在2016年開始嘗試使用冷凍電鏡。Astex與FEI（一家位于美國俄勒岡州的顯微鏡制造商）、英國醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實驗室和劍橋大學(xué)納米科學(xué)中心一起參與了一項幫助制藥公司探索基于冷凍電鏡進行早期藥物發(fā)現(xiàn)研究的項目。Astex公司的分子科學(xué)高級主管Pamela Williams博士說：“對我和我的同事們來說，要跳出舒適圈去學(xué)習(xí)冷凍電鏡技術(shù)是十分艱難的。多年來，我們已經(jīng)習(xí)慣于為X射線晶體學(xué)開發(fā)的高通量、自動化工作流程。而冷凍電鏡又是一種技術(shù)性極強的設(shè)備。”2020年，Williams博士及其同事進行了一項概念驗證研究，并取得了鼓舞人心的結(jié)果。這項研究證明了冷凍電鏡技術(shù)在Astex公司的專業(yè)領(lǐng)域—基于片段的藥物設(shè)計方法中的效用。這種方法通過篩選小片段的方式，研究它們?nèi)绾螁为毰c蛋白質(zhì)結(jié)合。其片段可以反復(fù)擴展，以建立一個能有效與蛋白質(zhì)結(jié)合的分子。該研究表明冷凍電鏡確實可以用來研究小片段和蛋白質(zhì)之間的分子相互作用——在這種情況下，冷凍電鏡解析出的熱門腫瘤學(xué)靶點丙酮酸激酶的分辨率能夠與X射線晶體學(xué)相媲美。Astex公司正在利用冷凍電鏡將基于片段的藥物設(shè)計應(yīng)用于膜蛋白靶點，如涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶點。Williams博士認為冷凍電鏡可以與X射線晶體學(xué)相結(jié)合。例如在設(shè)計破壞兩種蛋白質(zhì)之間結(jié)合位點的藥物時，冷凍電鏡可用于生成蛋白質(zhì)復(fù)合物的圖像，而X射線晶體學(xué)可用于單獨獲取每個蛋白質(zhì)的詳細外觀。她堅持認為這兩種技術(shù)有可能并肩工作。解決冷凍電鏡的數(shù)據(jù)存儲問題Quobyte公司是一家位于加州圣克拉拉的存儲公司，其首席執(zhí)行官Bj?rn Kolbeck博士注意到了近年來許多生命科學(xué)領(lǐng)域數(shù)據(jù)的大幅增長，特別是冷凍電鏡的數(shù)據(jù)。冷凍電鏡需要積累許多高分辨率的蛋白質(zhì)圖像，因為這些圖像是實現(xiàn)蛋白質(zhì)的三維重建所必需的。Kolbeck指出，這比生命科學(xué)領(lǐng)域的其他成像技術(shù)所需的數(shù)據(jù)要多得多。在這種情況下，擁有一個強大而高效的數(shù)據(jù)存儲系統(tǒng)是至關(guān)重要的。它能與生成的數(shù)據(jù)量相適應(yīng)，并且允許顯微鏡的連續(xù)運行和圖像的快速處理。但對于使用冷凍電鏡的科學(xué)家來說，在很多時候存儲并不是當時需要考慮的事情。而許多人將他們的數(shù)據(jù)存儲在單獨的服務(wù)器上，因此如果系統(tǒng)發(fā)生了崩潰，那就會產(chǎn)生單點故障。小型制藥和生物技術(shù)公司往往在一開始就將他們的數(shù)據(jù)存儲在云端。Kolbeck認為這種方法很快就會變得非常昂貴，并且當數(shù)據(jù)需要從顯微鏡等現(xiàn)場設(shè)備中轉(zhuǎn)移時，得到的效果并不理想。而Quobyte的軟件能做的更好，因為該系統(tǒng)本質(zhì)上是將多個服務(wù)器的數(shù)據(jù)匯總到一個大的存儲系統(tǒng)。這樣一來就可以根據(jù)需要增加更多的服務(wù)器，而且如果一臺服務(wù)器出現(xiàn)故障或需要維修，其存儲仍然可用。

自兩年前該公司開始宣傳其用于冷凍電鏡的軟件以來，就引起了學(xué)術(shù)團體和藥物開發(fā)商的興趣。Kolbeck預(yù)測隨著冷凍電鏡的發(fā)展，數(shù)據(jù)存儲的需求也將增長。他說：“從存儲的角度來看，它的需求只會變得更大?！?/p>

冷凍電鏡的未來賽默飛世爾科技公司高級總監(jiān)兼制藥業(yè)總經(jīng)理Melanie Adams-Cioaba博士說，冷凍電鏡技術(shù)確實有了長足的進步。賽默飛位于馬薩諸塞州沃爾瑟姆，該公司提供一系列的實驗室儀器和用品—包括冷凍電鏡相關(guān)的儀器。該公司自2016年以來一直在銷售冷凍電鏡。2016年賽默飛收購了FEI公司，而FEI是開發(fā)電子顯微鏡的行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者。賽默飛提供的儀器包括Titan Krios顯微鏡，而這種顯微鏡在2020年拍攝了去鐵蛋白標志性的原子級分辨率圖像。Adams-Cioaba博士指出，隨著冷凍電鏡技術(shù)的進步，該技術(shù)已被確立為應(yīng)對難以結(jié)晶的靶點的首選方法，而現(xiàn)在冷凍電鏡的應(yīng)用也正在迅速發(fā)展。其中冷凍電鏡的熱門應(yīng)用之一是對大型和靈活的生物制品（如治療性抗體）進行成像。Adams-Cioaba博士補充說；“冷凍電鏡能在任何我們真正想了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的地方發(fā)揮作用，像蛋白質(zhì)如何與其他蛋白質(zhì)相互作用，以及這些蛋白質(zhì)的變化如何影響蛋白質(zhì)的功能。”例如制藥商可以使用冷凍電鏡來幫助他們篩選針對某種特定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的大量抗體。這樣的結(jié)構(gòu)分析可以使其快速地按結(jié)構(gòu)對抗體進行分類，并選擇那些具有最大治療前景的抗體。歷史上，結(jié)構(gòu)生物學(xué)很少在抗體開發(fā)的早期階段被運用，其中部分原因因為是蛋白質(zhì)不容易結(jié)晶。但由于冷凍電鏡能夠快速地進行結(jié)構(gòu)解析，該技術(shù)允許結(jié)構(gòu)生物學(xué)在這個過程中更早地指導(dǎo)抗體的開發(fā)。Adams-Cioaba博士預(yù)計，冷凍電鏡將繼續(xù)在藥物開發(fā)中找到新的應(yīng)用，而該領(lǐng)域的創(chuàng)新組合也將持續(xù)打破她的認知障礙。Adams-Cioaba還認為，冷凍電鏡的無限可能性正受到人類的思維慣性和想象力的限制。

水木未來丨視界iss.41

Credit@Katarina Zimmer, GEN News

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