CRISPR-U?基因敲入iPSC細(xì)胞系：

通過(guò)核轉(zhuǎn)染法將gRNA、Cas9和Donor共轉(zhuǎn)入iPSC細(xì)胞中，進(jìn)行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進(jìn)行靶位點(diǎn)擴(kuò)增及測(cè)序，篩選出敲入純合的陽(yáng)性克隆。敲入熒光報(bào)告基因的也可以通過(guò)觀察熒光進(jìn)行初步篩選。

敲入方案：

特定位點(diǎn)融合蛋白：

gRNA和Cas9復(fù)合物造成靶位點(diǎn)DNA雙鏈斷裂后，iPSC細(xì)胞以外源攜帶敲入片段的Donor作為模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），將敲入片段重組到基因組靶位點(diǎn)。

基因定點(diǎn)過(guò)表達(dá):

人類iPSC在hROSA26和AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)敲入感興趣的基因，即可以避免片段在基因組隨機(jī)插入，又可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因過(guò)表達(dá)。

源井生物的細(xì)胞系基因編輯專家使用CRISPR-U?技術(shù)設(shè)計(jì)您的安全港基因敲入iPSC模型，生成滿足您特定研究需要的細(xì)胞系模型。

應(yīng)用案例：

通過(guò)構(gòu)建以AAVS1位點(diǎn)為靶點(diǎn)的AAVS1-Cas9-sgRNA質(zhì)粒和AAVS1-EF1α-F9 cDNA嘌呤霉素donor 載體，并將其導(dǎo)入iPSC。將F9 cDNA成功插入AAVS1位點(diǎn)的iPSCs分化為肝細(xì)胞，在培養(yǎng)上清中成功檢測(cè)到人因子IX（hFIX）抗原和活性。最后，通過(guò)脾臟注射將肝細(xì)胞移植到非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷?。∟OD/SCID）小鼠體內(nèi)。

iPSC轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用嘌呤霉素進(jìn)行藥物篩選。大多數(shù)iPSCs在藥物選擇后死亡，但少數(shù)存活下來(lái)。大約7天后，每個(gè)存活的iPSC的克隆都長(zhǎng)得足夠大，可以在兩組（圖a，b）中進(jìn)行進(jìn)一步的插入檢測(cè)。從中挑選出6個(gè)克隆。如圖c所示，用引物可在所有iPSC克隆中檢測(cè)到1.3kb的片段；用另外一對(duì)引物可在iPSC克隆1、2、3、4和6中檢測(cè)到468bp和4.9kb的片段，表明F9 cDNA雜合插入；在iPSC克隆5中只能檢測(cè)到4.9kb的片段，表明F9 cDNA純合插入。

參考文獻(xiàn)：

Lyu, Cuicui, et al. "Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells from patients with hemophilia B using the CRISPR-Cas9 system."?Stem cell research & therapy?9.1 (2018): 92.

iPSC誘導(dǎo)分化

由于人胚胎干細(xì)胞來(lái)源于早期胚胎而使其研究備受倫理爭(zhēng)議，而且人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的分化細(xì)胞進(jìn)行異體移植時(shí)存在排斥反應(yīng)，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。iPSC來(lái)源于多種體細(xì)胞，可以誘導(dǎo)分化為不同種類的細(xì)胞用于科學(xué)研究。

源井生物的iPSC技術(shù)平臺(tái)集中在分化的開發(fā)上，提高了從患者組織（如成纖維細(xì)胞）或現(xiàn)有的iPSC中產(chǎn)生具有功能的、成熟的肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、T細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞和胰島細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)流程

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