熒光素酶干貨系列③ | 【應(yīng)用篇】 轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作驗證
熒光素酶作為一種理想的報告基因，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點與啟動子活性分析、RNA降解、信號轉(zhuǎn)導、藥物篩選、動物活體成像等領(lǐng)域。前兩期為大家介紹了熒光素酶的發(fā)展和原理以及在miRNA與靶基因結(jié)合方面的應(yīng)用。本期就來詳細聊聊雙熒光素酶在轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作驗證方面的應(yīng)用。
真核生物基因表達是一個十分復(fù)雜而有序的過程，是眾多的反式因子和順式作用元件之間相互作用的結(jié)果。基因的表達在各個層次上都受到精密的調(diào)控（包括染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后加工等水平的調(diào)控）。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控發(fā)生在基因表達的初期階段，是很多基因表達調(diào)控的主要方式之一，該過程是指一類稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)特異地結(jié)合到靶基因調(diào)控區(qū)的順式作用元件上，或調(diào)節(jié)基因表達的強度，或控制靶基因的時空特異性表達，或應(yīng)答外界刺激和環(huán)境脅迫，最終呈現(xiàn)生物體不同的表征，對生命的正常發(fā)育和進化至關(guān)重要。
圖1. 基因轉(zhuǎn)錄機制示意圖
作為基因表達調(diào)控的開關(guān)，啟動子是一段控制基因表達的DNA序列，由許多元件組成，能夠與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并在調(diào)控基因表達中起著關(guān)鍵作用。最重要的元件是TATA盒（一段6-8堿基序列），它是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的關(guān)鍵信號點。此外，還有CAAT盒、GC盒和增強子等元件，它們也具有重要的調(diào)控功能。這些元件的排列組合和序列多樣性導致基因啟動子在不同類型細胞中具有不同的調(diào)控特征。
一、目的基因啟動子序列獲取及與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點預(yù)測
在線網(wǎng)站UCSC（http://www.genome.ucsc.edu/）或NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）均可獲取指定基因的啟動子序列；結(jié)合位點可通過在線網(wǎng)站JASPAR （https://jaspar.genereg.net/）進行預(yù)測。詳細方法可關(guān)注“小恒學術(shù)”視頻號，觀看往期相關(guān)視頻。常用增強子查詢數(shù)據(jù)庫：EnhancerAtlas（http://www.enhanceratlas.org/）、dbSUPER（https://asntech.org/dbsuper/）等。
二、雙熒光素酶驗證系統(tǒng)相應(yīng)質(zhì)粒體系及分組
漢恒出品用于啟動子活性及與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合驗證的雙熒光素酶報告系統(tǒng)：pGL3-Basic，將待分析啟動子元件序列構(gòu)建到F-Luciferase上游；pcDNA3.1，用于過表達待測轉(zhuǎn)錄因子。用于增強子/抑制子研究的雙熒光素酶報告系統(tǒng)包括：pGL3-Promoter，將待分析增強子/抑制子序列構(gòu)建到啟動子上游。兩個系統(tǒng)均需要共轉(zhuǎn)pRL-TK，用于表達RLuc的內(nèi)參質(zhì)粒。
圖3. 啟動子和轉(zhuǎn)錄因子互作雙熒光素酶質(zhì)粒系統(tǒng)
圖4. 增強子/抑制子雙熒光素酶質(zhì)粒系統(tǒng)
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學發(fā)光反應(yīng)的特性，把待研究的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。同時可轉(zhuǎn)染表達R-Luciferase的內(nèi)參載體pRL-TK質(zhì)粒以校正不同樣品之間的轉(zhuǎn)染效率。
圖5. 雙熒光素酶系統(tǒng)反應(yīng)過程
三、雙熒光素酶系統(tǒng)的應(yīng)用潛在啟動子/啟動子核心區(qū)活性檢測
方法：截斷式檢測，逐步缺失遠端序列（因為核心啟動子位于靠近TSS端，缺失該處會喪失基本轉(zhuǎn)錄活性）；適用于確定啟動子核心區(qū)域或轉(zhuǎn)錄因子與啟動子預(yù)測結(jié)合位點較多且評分相近，需要進一步縮小范圍的情況。（攜帶目的啟動子的報告載體promoter、不攜帶目的啟動子的報告載體promoter-空載），一般選取目的基因上游總長為2000bp堿基作為目標基因的啟動子序列。
圖6. 啟動子截斷示意圖
表1. 啟動子活性驗證雙熒光素酶實驗分組
1/2組去背景值后通過熒光素酶活性對比可驗證待測啟動子活性；2/3/4/5去背景值后可通過熒光素酶活性驗證待測啟動子核心區(qū)域。
潛在增強子/抑制子等調(diào)控子活性檢測
將增強子/抑制子的調(diào)控元件構(gòu)建至pGL3-Promoter報告載體（攜帶目的基因啟動子或廣譜啟動子啟動報告基因），并檢測雙熒光素酶活性。（增強子Enhancer舉例）
表2. 增強子活性驗證雙熒光素酶實驗分組
1/2組熒光素酶活性對比表示目的啟動子的啟動活性；1/3組熒光素酶活性對比表示增強子是否具備啟動轉(zhuǎn)錄活性；2/4組熒光素酶活性對比表示增強子對下游基因啟動轉(zhuǎn)錄增強的效果。
啟動子和轉(zhuǎn)錄因子互作驗證
轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至啟動子區(qū)域，并改變其啟動子功能的強弱，便可引起下游報告基因Fluc轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，進而影響其蛋白翻譯，最終底物與熒光素酶反應(yīng)發(fā)生變化，熒光強弱發(fā)生改變，最終達成互作功能驗證。
1）驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子是否有互作（轉(zhuǎn)錄因子過表達載體TF、過表達空載TF-空載）
表3. 啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合驗證雙熒光素酶實驗分組
2）在四組的基礎(chǔ)上加上各個待驗證結(jié)合位點突變啟動子載體，以驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的具體結(jié)合位點（結(jié)合位點1突變啟動子promoter-mut1、結(jié)合位點2突變啟動子promoter-mut2、結(jié)合位點3突變啟動子promoter-mut3，多一個待驗證結(jié)合位點，則加一組對應(yīng)啟動子突變體+TF和啟動子突變體+TF-空載）
表4. 啟動子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點驗證雙熒光素酶實驗分組
各組設(shè)置的意義：實驗組1，空載對照組；實驗組2，轉(zhuǎn)錄因子在無啟動子的情況下對Fluc表達的影響；實驗組3，檢測在無轉(zhuǎn)錄因子的作用下，啟動子對Fluc基因的轉(zhuǎn)錄作用強度；實驗組4，檢測在待驗轉(zhuǎn)錄因子的作用下，啟動子的轉(zhuǎn)錄活性是否會發(fā)生改變，用以判斷待驗的轉(zhuǎn)錄因子與啟動子是否存在互作關(guān)系；實驗組6-10：確定具體結(jié)合位點。
四、案例分析
安徽醫(yī)科大學李維祖教授在研究顱內(nèi)動脈瘤時發(fā)現(xiàn)NOX4在TNF-α誘導的A7R5細胞中被激活，抑制TRPC6-NFATC1信號通路可顯著下調(diào)NOX4的表達。為驗證NFATC1與 NOX4的結(jié)合機制，作者通過人轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（HumanTFDB）預(yù)測到NFATC1在人NOX4啟動子區(qū)域可能結(jié)合的3個位點。利用pGL3-basic構(gòu)建了這3個可能結(jié)合位點（TFBSs）及相應(yīng)位點突變的報告載體。結(jié)果顯示NFATC1可以直接結(jié)合NOX4啟動子，參與NOX4轉(zhuǎn)錄，并確定了NFATC1可以結(jié)合到NOX4啟動子的TFBS2和TFBS3上，調(diào)控NOX4的轉(zhuǎn)錄。這些發(fā)現(xiàn)為了解顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制和延遲顱內(nèi)動脈瘤的必要策略提供了依據(jù)。
圖7. NFATC1與 NOX4啟動子的雙熒光素酶驗證
天津環(huán)湖醫(yī)院李慶國發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中KB-1460A1.5表現(xiàn)為低表達情況，為了解析這一機制，作者對KB-1460A1.5上游區(qū)域進行了分析。首先通過PROMO網(wǎng)站篩選了可能與KB-1460A1.5結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并通過這些因子在膠質(zhì)瘤中的表達與KB-1460A1.5的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)YY1極有可能參與調(diào)控KB-1460A1.5的表達。通過構(gòu)建YY1過表達載體及KB-1460A1.5啟動的pGL3載體進行雙熒光素酶報告基因檢測驗證。結(jié)果顯示，YY1可能與KB-1460A1.5啟動子結(jié)合，且YY1降低了KB-1460A1.5啟動子的熒光素酶活性，即YY1可能以負調(diào)控的方式調(diào)控KB-1460A1.5的轉(zhuǎn)錄表達。作者進而提出了KB-1460A1.5在膠質(zhì)瘤中的作用機制，KB-1460A1.5可能是膠質(zhì)瘤的治療靶點。
圖8. YY1與KB-1460A1.5啟動子雙熒光素酶驗證
本期干貨內(nèi)容主要為大家介紹了雙熒光素酶報告系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄因子與啟動子互作、啟動子活性，增強子/抑制子活性的應(yīng)用，包括原理及應(yīng)用思路，并附上了兩篇案例文獻，希望對正在做這方面實驗的小伙伴有所幫助。下期我們將介紹雙熒光素酶報告系統(tǒng)的拓展應(yīng)用，感興趣的小伙伴可以持續(xù)關(guān)注留意一下哦~~~
參考文獻
[1] Sun ZH, Liu F, Kong LL, Ji PM, Huang L, Zhou HM, Sun R, Luo J, Li WZ. Interruption of TRPC6-NFATC1 signaling inhibits NADPH oxidase 4 and VSMCs phenotypic switch in intracranial aneurysm. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114480.
[2] Xu L, Wu Q, Yan H, Shu C, Fan W, Tong X, Li Q. Long noncoding RNA KB-1460A1.5 inhibits glioma tumorigenesis via miR-130a-3p/TSC1/mTOR/YY1 feedback loop. Cancer Lett. 2022 Jan 28;525:33-45.?
