寫在前面

????????今天推薦的是由比利時(shí)布魯塞爾自由大學(xué)在2020年8月8日發(fā)表于Oncogene（2020IF：9.866，JCR Q1）的一篇文章，通訊作者是Gustavo J. Gutierrez教授，研究表明USP13控制Aurora B的穩(wěn)定性影響整個(gè)細(xì)胞周期的進(jìn)程。

研究背景

????????Aurora B激酶在有絲分裂中起重要作用。它的蛋白質(zhì)水平在有絲分裂開(kāi)始前增加，在有絲分裂結(jié)束時(shí)急劇下降。后者的減少是由于E3泛素連接酶后期促進(jìn)復(fù)合物或環(huán)體與去泛素化酶USP35的作用之間的平衡。Aurora B還在相間執(zhí)行重要功能。間期Aurora B的異常調(diào)節(jié)導(dǎo)致細(xì)胞周期缺陷，通常與異常的染色體濃縮和分離有關(guān)。然而，人們對(duì)Aurora B水平如何在相間進(jìn)行調(diào)節(jié)知之甚少。

摘要部分

????????在這里，作者發(fā)現(xiàn)USP13與細(xì)胞中的Aurora B相關(guān)并使其穩(wěn)定，尤其是在它們進(jìn)入有絲分裂之前。為了使USP13對(duì)Aurora B發(fā)揮穩(wěn)定作用，Aurora B介導(dǎo)的USP13在絲氨酸114處的磷酸化促進(jìn)了它們的結(jié)合。此外，作者報(bào)告指出SP13以非催化的方式使Aurora B去泛素化并保護(hù)它不被降解，對(duì)USP13的細(xì)胞水平/活性進(jìn)行遺傳或化學(xué)調(diào)控會(huì)影響細(xì)胞周期進(jìn)展?？偟膩?lái)說(shuō)，作者的研究揭示了USP13-Aurora B軸的分子和細(xì)胞聯(lián)系，它可能參與了發(fā)生在癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期的重構(gòu)。

研究?jī)?nèi)容

1.Aurora B在體外和細(xì)胞使USP13中的第114位絲氨酸磷酸化

????????已發(fā)現(xiàn)多個(gè)DUB受磷酸化調(diào)控，因此作者利用MIT-Scansite在線軟件來(lái)確定使USP13磷酸化的可能磷酸化位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)S114 似乎嵌入了激酶Aurora B和/或 PKA 的標(biāo)志性磷酸化基序中?？紤]到作者之前報(bào)道過(guò)USP13控制Skp2-p27軸從而影響細(xì)胞周期，而Aurora B激酶也參與細(xì)胞的控制循環(huán)，說(shuō)明兩者可能存在聯(lián)系。因此，作者使用全長(zhǎng)GST-USP13和重組Aurora B進(jìn)行了放射性體外激酶測(cè)定，作者發(fā)現(xiàn)Aurora B很容易磷酸化USP13，并且值得注意的是，S114 的突變轉(zhuǎn)化為丙氨酸（S114A 突變體）消除了該磷酸化過(guò)程。然后，作者生成了一種靶向人類USP13中磷酸化 S114 的位點(diǎn)特異性磷酸化抗體。作者首先制備了USP13磷酸化抗體，該抗體只能特異性檢測(cè)被Aurora B磷酸化的USP13。此外，作者在 HEK293T 細(xì)胞中測(cè)試了磷酸S114-USP13抗體，發(fā)現(xiàn)磷酸 S114-USP13抗體能夠檢測(cè)在 S114 處過(guò)表達(dá)的野生型USP13但不是任何突變版本的USP13。此外，作者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Aurora B的過(guò)表達(dá)特異性地增加了 S114處USP13的磷酸化，表明Aurora B確實(shí)可以靶向細(xì)胞中USP13的S114。最后，磷酸-S114-USP13抗體還能夠檢測(cè)到用 S-三苯甲基-L半胱氨酸處理的細(xì)胞中內(nèi)源性磷酸-S114-USP13的富集。

研究結(jié)論：Aurora B在絲氨酸114處磷酸化USP13。

?

2.USP13在體外和細(xì)胞中與Aurora B相互作用

????????作者探究這USP13和Aurora B是否可以相互作用。作者使用重組細(xì)菌純化的GST標(biāo)記和35S-蛋氨酸放射性標(biāo)記蛋白進(jìn)行Co-IP，發(fā)現(xiàn)USP13和Aurora B確實(shí)可以相互作用。作者使用在 HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)的Aurora B和USP13的進(jìn)行了相互免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)USP13很容易與Aurora B相互作用。最后，使用來(lái)自HeLa細(xì)胞的DSP交聯(lián)裂解物，作者能夠檢測(cè)到內(nèi)源性USP13和Aurora B之間的相互作用。但作者沒(méi)有檢測(cè)到?jīng)]有交聯(lián)劑情況下的相互作用，這表明Aurora B和USP13之間的結(jié)合可能非常不穩(wěn)定。然后作者研究了USP13在 S114 的磷酸化是否會(huì)影響其與Aurora B的相互作用，有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)USP13的 S114A 突變體與外源性和內(nèi)源性Aurora B相互作用的效率較低。

研究結(jié)論：Aurora B和USP13之間存在復(fù)合物，依賴于USP13在絲氨酸114處的磷酸化，且該磷酸化由Aurora B介導(dǎo)。

?

3.USP13調(diào)節(jié)細(xì)胞中的Aurora B穩(wěn)定性

????????作者注意到USP13和Aurora B的共表達(dá)導(dǎo)致總Aurora B穩(wěn)態(tài)水平的增加。作者推斷USP13可以通過(guò)去泛素化調(diào)節(jié)Aurora B水平。作者發(fā)現(xiàn)USP13在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)確實(shí)能夠增加內(nèi)源性和外源性Aurora B的總體水平，并且后一種效應(yīng)是劑量依賴性的。

????????另一方面，作者比較了Aurora B在指數(shù)增長(zhǎng)的USP13敲低 (KD) 細(xì)胞中的總體穩(wěn)態(tài)水平，與對(duì)照細(xì)胞相比，當(dāng)USP13的水平降低時(shí)，內(nèi)源性Aurora B的穩(wěn)態(tài)水平降低。有趣的是，作者還觀察到外源Aurora B在USP13-KD細(xì)胞中穩(wěn)定性的增強(qiáng)通過(guò)回補(bǔ)USP13后消失。此外，spautin-1對(duì)USP13的化學(xué)抑制也降低了細(xì)胞中的內(nèi)源性Aurora B水平。

研究結(jié)論：USP13調(diào)節(jié)細(xì)胞中的Aurora B穩(wěn)定性。

?

4.USP13調(diào)節(jié)Aurora B的細(xì)胞半衰期

????????由于USP13增加了Aurora B在細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)水平，作者測(cè)試了對(duì)USP13水平的調(diào)節(jié)是否直接影響了Aurora B的半衰期。為此，作者用蛋白合成抑制劑環(huán)己酮處理過(guò)表達(dá)Aurora B的細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)USP13后，Aurora B的半衰期增加。相反，作者觀察到，在USP13-KD細(xì)胞中，內(nèi)源性Aurora B的半衰期降低了。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)USP13的細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂之前，內(nèi)源性Aurora B的水平增加，而細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá)沒(méi)有改變。而USP13-KD細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂時(shí)顯示出內(nèi)源性Aurora B水平下降。作者還研究了在有無(wú)USP13過(guò)表達(dá)的情況下在有絲分裂結(jié)束時(shí)Aurora B的穩(wěn)定性，在這個(gè)細(xì)胞周期階段，Aurora B水平在APC/CCdh1的作用下會(huì)下降。作者觀察到，USP13的調(diào)節(jié)并沒(méi)有改變有絲分裂結(jié)束期間Aurora B下調(diào)的動(dòng)力學(xué)，表明USP13并不直接對(duì)抗有絲分裂結(jié)束時(shí)的細(xì)胞中的APC/CCdh1，而是在細(xì)胞周期的G2-M轉(zhuǎn)換期間發(fā)揮作用，以便使Aurora B水平正確增加。為了證實(shí)這一假設(shè)，作者評(píng)估了Aurora B在RO-3306（一種可逆的CDK1抑制劑，可阻斷G2期的細(xì)胞）和環(huán)己酮存在下的半衰期，發(fā)現(xiàn)當(dāng)USP13過(guò)量表達(dá)時(shí)，Aurora B的半衰期會(huì)增加。

研究結(jié)論：USP13調(diào)節(jié)Aurora B的細(xì)胞半衰期。

?

5.USP13通過(guò)酶非依賴機(jī)制控制Aurora B的穩(wěn)定性? ? ?

????????為了表征USP13對(duì)Aurora B的穩(wěn)定作用所需的可能的分子機(jī)制，作者發(fā)現(xiàn)USP13催化失活的C345A突變體與其野生型 (WT) USP13都能夠上調(diào)細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性Aurora B的水平。表明即使在沒(méi)有催化活性的情況下，USP13也能夠穩(wěn)定細(xì)胞中的Aurora B。此外，作者探究了USP13在S114處的磷酸化是否調(diào)節(jié)其他底物。為此，作者在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)USP13-WT或-S114A突變體，發(fā)現(xiàn)USP13-S114A突變體在穩(wěn)定Aurora B和Skp2方面的效率低于USP13-WT。相比之下，USP13-WT和-S114A之間在 MCL1（另一種參與細(xì)胞存活的USP13底物）的穩(wěn)定性方面沒(méi)有差異。

????????因此，作者評(píng)估了細(xì)胞中存在或不存在USP13時(shí)Aurora B的泛素化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)USP13的過(guò)量表達(dá)降低了泛素化Aurora B的水平，而USP13 KD增強(qiáng)了Aurora B的泛素化。此外，USP13-C345A也能降低細(xì)胞中泛素化的Aurora B的水平，這可能解釋了該突變體穩(wěn)定Aurora B的能力。

研究結(jié)論：USP13可以通過(guò)調(diào)節(jié)Aurora B的泛素化，即去除或編輯Aurora B上存在的泛素化標(biāo)記來(lái)控制Aurora B的穩(wěn)定性，其機(jī)制似乎與其催化活性無(wú)關(guān)。

?

6.USP13影響細(xì)胞周期的進(jìn)程

????????由于USP13通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)Aurora B水平并微調(diào) Skp2、c-myc和 p53等蛋白質(zhì)的水平，這些蛋白質(zhì)也參與其中在細(xì)胞增殖方面，作者假設(shè)細(xì)胞中USP13水平的調(diào)節(jié)可能會(huì)影響它們的細(xì)胞周期。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者首先進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn) U2OS 細(xì)胞中USP13的過(guò)表達(dá)在24小時(shí)后增加了它們的G2/M種群，并且在48小時(shí)后增加了它們的>4n種群，表明胞質(zhì)分裂失敗，并表明在USP13水平升高的情況下確實(shí)會(huì)影響細(xì)胞分裂。然后作者通過(guò)免疫熒光顯微鏡分析自由分裂的外源表達(dá)USP13的細(xì)胞，并觀察到磷酸化組蛋白H3的水平增加，表明USP13過(guò)表達(dá)導(dǎo)致活性Aurora B激酶的水平提高。此外，通過(guò)延時(shí)顯微鏡對(duì)表達(dá)外源USP13的U2OS細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，顯示進(jìn)入有絲分裂的速度降低?？傮w而言，這些分析表明U2OS細(xì)胞中USP13的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致G2或前期停滯，磷酸化組蛋白H3水平異常。

????????相反，作者發(fā)現(xiàn)spautin-1對(duì)USP13的化學(xué)抑制增加了G1中U2OS 細(xì)胞的數(shù)量，從而損害了相應(yīng)的G2/M群體。此外，在spautin-1存在下穩(wěn)定表達(dá)Aurora B-Venus 的U2OS細(xì)胞的延時(shí)顯微鏡顯示前期細(xì)胞數(shù)量減少，證實(shí)了spautin-1阻礙了它們進(jìn)入有絲分裂。與通過(guò)spautin-1化學(xué)抑制USP13的結(jié)果一致，USP13-KD細(xì)胞的G1群體也顯示出輕微增加。最后，用STLC處理細(xì)胞顯示USP13-KD細(xì)胞在有絲分裂中積累的能力降低，表明在沒(méi)有USP13的情況下，細(xì)胞傾向于停留在G1期。

研究結(jié)論：細(xì)胞中USP13的水平對(duì)細(xì)胞在周期中不受干擾至關(guān)重要。

?

結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中，作者首次報(bào)告了USP13和致癌性Aurora B激酶之間存在的分子和細(xì)胞聯(lián)系。USP13的水平對(duì)細(xì)胞在周期中不受干擾至關(guān)重要。USP13與Aurora B相互作用，通過(guò)不依賴其催化活性的機(jī)制控制其在細(xì)胞周期中的穩(wěn)定性。另一方面，作者發(fā)現(xiàn)Aurora B在絲氨酸114處對(duì)USP13進(jìn)行磷酸化，促使它們相互作用。作者的研究結(jié)果揭示了在細(xì)胞周期中發(fā)生的異常情況與一些人類癌癥中報(bào)道的Aurora B和USP13的異常水平之間的潛在聯(lián)系。

?

Thank you!

?

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41388-020-01396-8