甲型流感病毒（IAV）由于其大流行和季節(jié)性流行，對公共衛(wèi)生和社會經(jīng)濟(jì)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。IAV利用宿主細(xì)胞機(jī)制促進(jìn)其復(fù)制，而宿主先天免疫系統(tǒng)可誘導(dǎo)多種抗病毒藥物對抗IAV感染。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)環(huán)狀RNA的表達(dá)水平在IAV感染后發(fā)生了顯著變化，并參與了病毒感染和抗病毒免疫應(yīng)答。然而，大多數(shù)環(huán)狀RNA在IAV感染中的生物遺傳過程、潛在功能和潛在機(jī)制尚不清楚。

2023年8月21日，中國科學(xué)院微生物研究所致病性微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李晶、葉昕、劉文軍團(tuán)隊(duì)在PLoS Pathogens（IF=6.7)發(fā)表文章“The circRNA circVAMP3 restricts influenza A virus replication by interfering with NP and NS1 proteins”。作者篩選了三種IAV菌株的環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄譜，以鑒定參與該病毒復(fù)制的環(huán)狀RNA。在IAV感染過程中，IFN-β能誘導(dǎo)circVAMP3且表達(dá)水平增幅最大。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，circVAMP3的形成是由QKI-5介導(dǎo)的，而QKI-5作為病毒蛋白的誘餌來抑制IAV復(fù)制，為環(huán)狀RNA對抗IAV感染的作用提供了新的見解。

IAV感染和IFN-β刺激均可上調(diào)circVAMP3

首先通過RNA測序和RT-qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006354在IAV感染時(shí)上調(diào)最為顯著。接著Sanger測序發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006354來自位于人類1號染色體上的VAMP3基因外顯子3和4，并因此被命名為circVAMP3。RNase R和放線菌素D實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)circVAMP3結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有更長的半衰期。FISH結(jié)果顯示，circVAMP3主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中的水平很低。總之，circVAMP3在IAV感染或IFN-β刺激時(shí)高水平表達(dá)，并主要位于細(xì)胞質(zhì)中。

QKI-5促進(jìn)circVAMP3的生成

病毒滴度劑量測定發(fā)現(xiàn)，QKI-5蛋白水平隨著WSN病毒滴度的升高而逐漸升高，其他IAV菌株與WSN感染一致，所有病毒都能顯著上調(diào)QKI-5蛋白水平。同時(shí)，IFN-β也以劑量依賴的方式顯著上調(diào)了QKI-5的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平。結(jié)果表明，IAV可誘導(dǎo)QKI-5轉(zhuǎn)錄本的顯著增加。

作者用siRNA敲低QKI-5發(fā)現(xiàn)，circVAMP3的生成顯著減少；而過表達(dá)QKI-5則增加了circVAMP3的表達(dá)。RIP實(shí)驗(yàn)表明，QKI與VAMP3前體mRNA外顯子鄰近位點(diǎn)具有結(jié)合作用。結(jié)果表明，IAV感染和IFN-β刺激誘導(dǎo)的QKI-5表達(dá)能促進(jìn)circVAMP3的生成。

CircVAMP3限制了IAV的復(fù)制（體外實(shí)驗(yàn)）

通過WSN病毒感染兩種不同的過表達(dá)circVAMP3的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)circVAMP3過表達(dá)顯著降低了病毒的滴度和病毒蛋白M1和NP的水平；WB結(jié)果表明，隨著circVAMP3轉(zhuǎn)染劑量的逐漸增加，NP和M1蛋白水平逐漸降低；而敲低circVAMP3后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相反，表明過表達(dá)circVAMP3可以顯著抑制IAV的復(fù)制，且呈劑量依賴性。另外，作者也檢測了WSN在A549-circVAMP3細(xì)胞中不同時(shí)間點(diǎn)的復(fù)制能力，結(jié)果顯示，A549-circVAMP3細(xì)胞的病毒滴度在每個(gè)指定的時(shí)間點(diǎn)均有明顯的降低。同時(shí)，作者用不同亞型IAVs感染A549-circVAMP3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)A549-circVAMP3細(xì)胞中多種亞型IAVs的病毒滴度均明顯低于對照細(xì)胞。綜上表明，circVAMP3可以較長時(shí)間強(qiáng)烈抑制WSN的復(fù)制和增殖，并能抑制多株IAV的增殖。

CircVAMP3限制了IAV的復(fù)制和發(fā)病機(jī)制（體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）

為了研究circVAMP3對體內(nèi)IAV感染的影響，通過AAV6-circVAMP3感染小鼠肺，RT-PCR證實(shí)，外源性circVAMP3于感染后3周在小鼠肺中表達(dá)。然后用WSN鼻內(nèi)感染小鼠，結(jié)果顯示AAV6-circVAMP3處理的小鼠比AAV6-NC或PBS處理的小鼠體重減輕更少，死亡率更低，存活時(shí)間更長。同時(shí)，circVAMP3也緩解了小鼠肺部的紅細(xì)胞外滲現(xiàn)象，減輕了肺水腫。空斑實(shí)驗(yàn)和IHC表明，經(jīng)AAV6-circVAMP3處理的小鼠肺部的病毒載量明顯低于對照。肺組織學(xué)分析顯示，AAV6-circVAMP3處理小鼠后，其肺泡損傷和間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤較輕。綜上所述，circVAMP3減少了IAV的復(fù)制和疾病發(fā)生。

CircVAMP3直接與IAV的NP和NS1相互作用

RNA pulldown、RIP和質(zhì)譜結(jié)果顯示，circVAMP3僅與病毒NP和NS1蛋白相互作用。然后作者又通過pulldown、WB、RT-qPCR、His-免疫共沉淀進(jìn)一步論證了circVAMP3可以直接與NP或NS1蛋白相互作用。

為了確定與circVAMP3相互作用的NP和NS區(qū)域，作者表達(dá)了兩個(gè)基于RNA結(jié)合域（RBD）位置的NP截?cái)囿w蛋白和NS1截?cái)囿w蛋白，并進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR結(jié)果顯示，circVAMP3與NP截?cái)嗤蛔凅w（aa182-498）和NS1截?cái)嗤蛔凅w（aa1-84）有相互作用。此外，circVAMP3的1-30、121-150、151-180和181-210nt這4個(gè)片段都與NP充分結(jié)合。綜上表明，circVAMP3直接與NS1（aa1-84）區(qū)域互作，且包含多個(gè)NS1結(jié)合位點(diǎn)。

CircVAMP3通過削弱NP與PB1或PB2的相互作用來抑制vRNP活性

NP是病毒核糖核蛋白（vRNP）復(fù)合物的重要組成部分，對vRNP活性至關(guān)重要。通過熒光素酶檢測，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circVAMP3的細(xì)胞的vRNP活性顯著降低；當(dāng)circVAMP3的表達(dá)減少時(shí)，vRNP活性增加。這表明circVAMP3抑制了病毒聚合酶活性，而回補(bǔ)circVAMP3又解除了這種抑制現(xiàn)象。另外，circVAMP3過表達(dá)降低了M1和NP的vRNA、cRNA和mRNA水平?？傊?，circVAMP3會損害vRNP復(fù)合物的活性，從而降低vRNA、cRNA和mRNA的合成。

NP(aa 182-498)包含NP自聚合區(qū)和PB1或PB2結(jié)合區(qū)。IP和WB實(shí)驗(yàn)證明circVAMP3并不影響NP的自聚合。過表達(dá)circVAMP3能降低NP與PB1或PB2的相互作用，同時(shí)也降低了NP與vRNA的相互作用。綜上所述，circVAMP3通過干擾NP與其他vRNP亞基的相互作用來抑制IAV聚合酶的活性。

CircVAMP3減輕了NS1對IFN-β激活的抑制作用，拮抗NS1與RIG-I的結(jié)合

NS1在抑制RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。RT-qPCR結(jié)果顯示，circVAMP3顯著增強(qiáng)了IFN-β mRNA的表達(dá)，而NS1蛋白則抑制了IFN-β的表達(dá)。此外，作者發(fā)現(xiàn)circVAMP3過表達(dá)顯著挽救了NS1蛋白誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象。同時(shí)，在A549穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞中，過表達(dá)circVAMP3能改善NS1對IFN-β表達(dá)的抑制作用。

Co-IP結(jié)果表明，circVAMP3的表達(dá)削弱了Myc-NS1對FLAG-RIG-I與Myc-TRIM25關(guān)聯(lián)的抑制作用。同時(shí)，circVAMP3能恢復(fù)被NS1抑制的RIG-I K63泛素化。以上說明circVAMP3通過減少NS1與RIG-I的相互作用來挽救RIG-I的激活。另外，RIG-I缺陷的293T細(xì)胞的病毒滴度和蛋白水平明顯高于野生型細(xì)胞。雖然過表達(dá)circVAMP3能顯著抑制了流感病毒的增殖，但在RIG-I缺陷的293T細(xì)胞中其抑制率降低。

總結(jié)

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)circVAMP3在IAV感染或IFN-β治療中表達(dá)上調(diào)。此外，IAV或IFN-β介導(dǎo)的QKI-5的上調(diào)介導(dǎo)了circVAMP3的生物發(fā)生。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，circVAMP3在限制IAV復(fù)制中發(fā)揮著重要作用。在機(jī)制上，circVAMP3通過干擾NP與PB1、PB2或vRNA的相互作用來抑制vRNP活性，并通過減輕NS1對RIG-I信號通路的抑制作用來恢復(fù)IFN-β的激活。

本研究中采用PIE方法體外制備circVAMP3，進(jìn)一步闡明circVAMP3的功能發(fā)揮機(jī)制。目前，circRNA因獨(dú)特的閉環(huán)結(jié)構(gòu)而穩(wěn)定性更強(qiáng)，作為線性mRNA的有效替代品，是下一代基因治療開發(fā)的理想平臺。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011577