衰老是植物生命周期中不可缺少的過程，而植物激素在葉片衰老過程中起著關(guān)鍵作用，其中脫落酸(ABA)、乙烯、茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)是促進(jìn)葉片衰老的重要物質(zhì)。其中ABA介導(dǎo)植物的多種生理過程，如氣孔關(guān)閉、葉片衰老、種子休眠和滲透調(diào)節(jié)等。盡管ABA的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及它們的調(diào)控已經(jīng)得到了廣泛的了解，但ABA是如何通過轉(zhuǎn)運被調(diào)節(jié)的還不清楚。

2022年5月，浙江大學(xué)丁忠杰教授團(tuán)隊于Journal of Integrative Plant Biology?(IF 9.106)發(fā)表了題為“RING‐box proteins regulate leaf senescence and stomatal closure via repression of ABA transporter gene?ABCG40”文章，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)及修飾蛋白質(zhì)組學(xué)，研究發(fā)現(xiàn)了兩種未被鑒定的RING-box蛋白，衰老泛素連接酶1和2 （ULS1和ULS2），并證明其在ABA信號反饋抑制中作為ABCG40依賴的ABA轉(zhuǎn)運負(fù)調(diào)控因子，控制葉片衰老和氣孔關(guān)閉，這對ABA轉(zhuǎn)運調(diào)控及其對葉片衰老影響的理解提供了幫助。其中，中科新生命為該研究提供了泛素化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)。

?研究材料

野生型擬南芥及其突變體

?技術(shù)路線

步驟1：缺乏ULS1和ULS2促進(jìn)葉片衰老；

步驟2：探究ULS1/2的表達(dá)模式；

步驟3：ULS1和ULS2功能的喪失促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的葉片衰老；

步驟4：ULS1/2抑制成熟葉片中ABA的積累；

步驟5：RNA‐seq揭示uls1/uls2中高表達(dá)ABA的轉(zhuǎn)運基因ABCG40；

步驟6：ULS1/2介導(dǎo)的葉片衰老依賴于ABCG40；

步驟7：ULS1/2參與ABCG40依賴的氣孔運動；

步驟8：定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示uls1/uls2中存在差異的泛素化蛋白。

?研究結(jié)果

1. 缺乏ULS1和ULS2促進(jìn)葉片衰老

作者首先基于擬南芥現(xiàn)有的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)兩個屬于RING‐V組的基因在衰老葉片中表達(dá)增加，并將其命名為ULS1和ULS2。接著作者通過生成一個雙突變體uls1/uls2，發(fā)現(xiàn)其比野生型和單突變型的葉片衰老明顯提前，葉片鮮重和葉綠素含量均降低。此外在此雙突變體中構(gòu)建原生啟動子驅(qū)動的ULSI和ULS2，發(fā)現(xiàn)這兩個基因均使uls1/uls2的葉片衰老程度恢復(fù)到野生型的水平。這些結(jié)果表明，ULS1和ULS2參與抑制擬南芥葉片衰老的過程。

2.?ULS1/2的表達(dá)模式

作者通過蛋白熒光表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ULS1和ULS2主要在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)膜系統(tǒng)中表達(dá)，并且在葉綠體中顯著富集。為了確定ULS1和ULS2的組織定位，作者構(gòu)建了由ULS1/2原生啟動子驅(qū)動的表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)基因株系（PULS1:GUS和PULS2:GUS），通過GUS染色，發(fā)現(xiàn)ULS1和ULS2主要表達(dá)在莖和根的維管組織中，在老葉中的表達(dá)高于幼葉，同時其在保衛(wèi)細(xì)胞、下胚軸及花中也進(jìn)行表達(dá)。此外，作者使用RT‐qPCR檢測發(fā)現(xiàn)ULS1和ULS2在未衰老的成熟葉(NL)和老葉(OL)中高度表達(dá)，ULS1同樣在花和角果中高度表達(dá)，表明其主要在成熟和衰老葉片中表達(dá)。

3. ?ULS1和ULS2功能的喪失促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的葉片衰老

為了探討ULS1和ULS2是如何參與葉片衰老過程的，作者分別用ABA、SA、MeJA、ACC和黑暗條件處理WT和uls1/uls2突變體的未衰老成熟葉片。結(jié)果表明，突變體uls1/uls2葉片衰老加速，葉綠素含量較對照組低。值得關(guān)注的是，只有ABA對uls1/ uls2突變體葉片衰老的促進(jìn)作用明顯大于WT，這表明ULS1和ULS2可能參與了ABA誘導(dǎo)的葉片衰老。為了驗證這一結(jié)果，作者測定了WT和uls1/uls2在添加或不添加ABA處理的離體葉片中與衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，與WT相比，uls1/ uls2葉片中葉綠素分解代謝基因(NYC1和NYE2)和衰老特異性基因(SAG12和SAG13)的表達(dá)顯著增加。此外，ABA能顯著提高uls1/uls2葉片中的基因轉(zhuǎn)錄水平，其中ULS1和ULS2的mRNA水平明顯受到ABA的誘導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)表明，ULS1和ULS2可能在ABA誘導(dǎo)的葉片衰老過程中起負(fù)調(diào)控作用。

4. ?ULS1/2抑制成熟葉片中ABA的積累

為了確定ULS1/2如何影響ABA誘導(dǎo)的葉片衰老，作者將擬南芥葉片分為三個發(fā)育階段，即ST1(早熟或幼葉)、ST2(成熟葉)和ST3(老葉)，并分別測量了葉片中的ABA含量。結(jié)果表明在WT和uls1/uls2植株中，ABA含量都隨著葉片發(fā)育而增加。此外，在ST2期，特別是ST3期，uls1/uls2葉片中的ABA積累遠(yuǎn)高于WT。這些數(shù)據(jù)表明，ULS1和ULS2可能通過抑制衰老葉片中ABA的積累來抑制葉片衰老。

5. ?RNA‐seq揭示uls1/uls2中高表達(dá)ABA的轉(zhuǎn)運基因ABCG40

為了進(jìn)一步探索ULS1和ULS2調(diào)控葉片衰老的分子機(jī)制，利用RNA‐seq對WT和uls1/uls2不同階段葉片中差異表達(dá)基因進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，在三個發(fā)育階段均有顯著性差異的50個基因中，ABA轉(zhuǎn)運體基因ABCG40的差異表達(dá)最為顯著，并通過RT-qPCR證實了這一結(jié)果。此外，在uls1/uls2離體葉片中，ABCG40的表達(dá)水平要高得多，且在ABA處理后進(jìn)一步增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，ABCG40的高表達(dá)可能是uls1/uls2突變體ABA積累和葉片衰老的原因之一。

6.??ULS1/2介導(dǎo)的葉片衰老依賴于ABCG40

緊接著作者開始驗證ULS1和ULS2是否通過ABCG40調(diào)節(jié)葉片衰老。他們通過構(gòu)建三重突變體uls1/uls2/abcg40，發(fā)現(xiàn)相比較于uls1/uls2，三重突變體在葉片衰老過程中表現(xiàn)出類似WT的表型。此外，與uls1/uls2相比，uls1/uls2/abcg40中衰老相關(guān)基因SAG12和NYC1的表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果表明，在缺乏ULS1和ULS2的植物中，ABCG40是導(dǎo)致葉片早期衰老的主要因素。為了進(jìn)一步證實ABCG40是否有助于增加uls1/uls2中ABA的積累，作者測定了ST3期葉片中的ABA含量，發(fā)現(xiàn)uls1/uls2/ ABCG40中ABA的積累明顯低于uls1/uls2。綜上這些數(shù)據(jù)表明，缺乏ULS1和ULS2會增加ABCG40的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)葉片中ABA的積累，導(dǎo)致葉片加速衰老。

7.? ULS1/2參與ABCG40依賴的氣孔運動

由于ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉需要ABCG40，因此作者接下來探究ULS1和ULS2是否參與氣孔運動的調(diào)節(jié)。與WT相比，在對照和ABA處理下，uls1/uls2的氣孔孔徑顯著減小，而abcg40突變可以很大程度上抑制uls1/uls2的氣孔關(guān)閉，這表明ULS1/2在ABCG40依賴的氣孔運動中起作用。與此一致的是，uls1/uls2的葉片失水率明顯低于WT和uls1/uls2/abcg40突變體。

8.? 定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示uls1/uls2中存在差異的泛素化蛋白

接下來文章進(jìn)一步挖掘ULS1/2如何影響ABCG40的表達(dá)。作者從4周齡的WT和uls1/uls2植物中取樣未衰老的成熟葉片，通過Label Free定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測體內(nèi)泛素化。結(jié)果表明共有65個在WT和uls1/uls2之間泛素化差異顯著的蛋白，其中15個蛋白參與ABA響應(yīng)和衰老過程，支持ULS1/2在ABA誘導(dǎo)的葉片衰老中的作用。此外，ABC轉(zhuǎn)運蛋白，特別是ABCG40，是uls1/uls2中泛素化水平最高的蛋白之一，表明ABCG40在uls1/uls2植物中豐富，其泛素化受到ULS1/ULS2的間接影響。

?小編小結(jié)

文章作者研究發(fā)現(xiàn)了兩個新的RING家族基因ULS1和ULS2，其通過抑制依賴于ABCG40的ABA運輸來調(diào)節(jié)葉片衰老和氣孔關(guān)閉，為ABA轉(zhuǎn)運在葉片衰老和氣孔關(guān)閉中不可或缺的作用提供了重要證據(jù)。