美國卡內(nèi)基梅隆大學(xué)Phil G. Campbell教授利用MicroFab的噴墨打印技術(shù)制備細(xì)胞外囊泡（EVs）微環(huán)境，解決了由于缺乏明確的固相外泌體/ECM微環(huán)境的體外模型的問題，用于研究外泌體介導(dǎo)的ECM效應(yīng)的機(jī)制，該技術(shù)也可以直接轉(zhuǎn)化為體內(nèi)應(yīng)用，用于向組織遞送局部外來體。

介紹

細(xì)胞外囊泡（EVs）是一種由蛋白質(zhì)磷脂膜包裹的異質(zhì)囊泡群，EVs存在于所有體液中，并在健康和疾病中介導(dǎo)局部和全身細(xì)胞間通訊，EV介導(dǎo)的細(xì)胞間通信在正常和病理生理?xiàng)l件下都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。外泌體是細(xì)胞外囊泡的一個子集，其運(yùn)輸多種細(xì)胞信號分子，與生長因子類似，外泌體以可溶液相形式和固定固相形式存在，結(jié)合在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）內(nèi)。外泌體因其作為疾病生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力而受到越來越多的關(guān)注（如圖1所示）。

▲ 圖1 組織微環(huán)境中存在的外泌體的示意圖

由于缺乏明確的固相外泌體/ECM微環(huán)境的體外模型，外泌體與ECM組分在細(xì)胞間通訊過程中的相互作用知之甚少，外泌體和ECM組分之間的這些相互作用機(jī)制可能決定了組織中外泌體驅(qū)動的重編程的程度，目前尚不清楚。美國卡內(nèi)基梅隆大學(xué)Phil G. Campbell教授利用MicroFab的噴墨打印技術(shù)（60μm口徑的噴頭）制備細(xì)胞外囊泡（EVs）微環(huán)境，從三種表型不同的巨噬細(xì)胞亞群中分離出外泌體，M0（非活化）、M1（促炎性）和M2（促再生）小鼠巨噬細(xì)胞。在生物制造過程中，評估了不同的生物墨水配方的噴墨可靠性和外泌體膜穩(wěn)定性，通過評估其對C2C12細(xì)胞肌生成的影響，評估生物打印微環(huán)境的生物活性。

▲ 圖2 外泌體墨水配方和生物印刷；a）定制噴墨生物打印機(jī)的照片；b）各種外來體生物墨水配方的Zeta潛在值；c）不同外泌體油墨配方的液滴體積；d）不同外來體油墨配方的液滴速度；e）珠上流式細(xì)胞儀直方圖，顯示生物打印過程中外來體膜的穩(wěn)定性。

Phil G. Campbell教授團(tuán)隊(duì)選擇了涂有100μg/ml 1型膠原的蓋玻片進(jìn)行體外研究（圖3A）。60μm噴頭以1.8±0.52 m/s的速度產(chǎn)生約70±4.87pl的液滴，沉積點(diǎn)徑約75μm。PKH26標(biāo)記的外泌體的濃度調(diào)制陣列的模式，每個尺寸為0.5mm×0.5mm，在1型膠原涂層的蓋玻片上創(chuàng)建，如圖3B所示。圖案由單個沉積液滴之間的80μm間距組成。為了研究噴嘴直徑對沉積液滴直徑的影響，使用雙噴墨設(shè)置（60μm和30μm）打印組合陣列，如圖3C所示。PKH67（偽綠色）標(biāo)記的外泌體用30μm噴頭打印，間距為100μm，沉積點(diǎn)徑為40μm，而PKH26（偽紅色）標(biāo)記的外泌體用60μm噴頭打印，間距為200μm，沉積點(diǎn)徑為75μm。如圖3D所示，M1和M2外泌體的印刷圖案在細(xì)胞培養(yǎng)條件下在1型膠原涂層蓋玻片上持續(xù)96小時(shí)。

▲ 圖3 a）PKH26標(biāo)記的外泌體與不同ECM涂覆的蓋玻片的結(jié)合效率；b）外泌體微環(huán)境對1型膠原涂層蓋玻片的打印調(diào)節(jié)，60μm噴頭產(chǎn)生直徑約75μm的點(diǎn)；c）兩種不同外泌體群體的組合陣列顯示了對沉積液滴分辨率的控制；d）外泌體模式在體外條件下持續(xù)4天。

結(jié)論

初次展示了高度受控的基于噴墨的生物制造，明確定義的外來體微環(huán)境具有生物活性，以空間受控的方式影響細(xì)胞行為。通過利用從不同巨噬細(xì)胞亞群（M0、M1和M2）分離的外泌體并通過測定其對C2C12細(xì)胞肌生成的影響，確認(rèn)了生物打印微環(huán)境的生物活性和對細(xì)胞反應(yīng)的空間控制。這些觀察結(jié)果可以轉(zhuǎn)化為固定化策略，允許制造定義明確的固相外泌體微環(huán)境，以更好地理解其生物學(xué)，并最終實(shí)現(xiàn)外源性載藥外泌體的可控、局部遞送，與其天然貨物協(xié)同工作。噴墨打印技術(shù)將有助于研究固相外泌體在生理和病理生理?xiàng)l件下的作用，并代表了一種定位外泌體遞送的新方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yerneni S S ,? Whiteside T L ,? Weiss L E , et al. Bioprinting exosome-like extracellular vesicle microenvironments[J]. Bioprinting, 2019.