1. 培養(yǎng)基配制注意事項(xiàng)

植物組織培養(yǎng)最常用MS培養(yǎng)基，包含十幾種化合物。有些化合物相遇會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，所以MS培養(yǎng)基需要配制多種高倍母液。

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配制母液時(shí)，尤其涉及大量元素的母液時(shí)，一定要等一種成分溶解之后，再緩慢的添加另一種成分；切記一鍋煮，即不能將各種化合物一齊添加進(jìn)去。

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2. 滅菌后培養(yǎng)基不凝膠或者凝膠偏軟

植物凝膠、瓊脂都對(duì)酸性條件敏感，pH 值低于5很難成膠或凝膠偏軟，切記高壓滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基?pH 值（5.5 - 6.0）。植物凝膠對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子濃度有要求，也就是相對(duì)于?MS 培養(yǎng)基，1 / 2 MS 培養(yǎng)基中植物凝膠要適當(dāng)增加用量。

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另外滅菌后，倒出培養(yǎng)基前一定將培養(yǎng)基搖勻（帶防燙手套），因?yàn)榄傊芏却蟮讓雍扛?，容易造成培養(yǎng)基強(qiáng)度不均勻。

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3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用過(guò)程中有無(wú)區(qū)別？

水解酪蛋白對(duì)胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，通常用量在?500 mg/L，不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，酶解更有利于發(fā)揮其作用。

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4. 怎么溶解組培常用植物激素？

IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應(yīng)先溶解于少量?95% 的乙醇中，再加水定容配制成母液。

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如有結(jié)晶析出，可考慮用?1 / 10 體積的乙醇溶解后再定容；2，4 -D 易溶于堿性水溶液，可用少量 1mol/L 的 NaOH 溶液溶解后再慢慢加水定容；KT 和 6 -BA 先用少量的 HCL 溶解，再加水定容到一定的濃度。

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5. 細(xì)胞分裂素使用濃度？

一般情況下在培養(yǎng)基中加入?0.1～10.0 mg/L 的細(xì)胞分裂素（6 -BA/KT/ZT)，多數(shù)用 1.0～2.0 mg/L，KT 濃度為 0.5～2 mg/L，濃度要根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料來(lái)調(diào)整。細(xì)胞分裂素可以單獨(dú)使用也可以與細(xì)胞生長(zhǎng)素配合使用。

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6. 哪些植物激素能高壓滅菌，哪些不能高壓滅菌？

IBA、NAA、6 -BA、2,4 -D 可高溫高壓滅菌。IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌，否則會(huì)分解失效，該類植物激素配制母液后需用 0.22 微孔濾膜過(guò)濾除菌，待培養(yǎng)基冷卻（50 - 60℃）后尚未凝膠前加入混勻。

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7. 培養(yǎng)基的 pH 值會(huì)凝膠硬度有無(wú)影響？

有影響。

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若將培養(yǎng)基?pH 值調(diào)的過(guò)高（大于 6），則培養(yǎng)基偏硬，增加接種的阻力，會(huì)對(duì)外植體造成損傷。

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若將培養(yǎng)基?pH 值調(diào)的過(guò)低（小于 4.5），則培養(yǎng)基不能凝固，起不到固定外植體的作用。一般將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)節(jié)至 5.5～6.0 為宜。

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8. 滅菌過(guò)程是否影響培養(yǎng)基的?pH 值？

培養(yǎng)基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過(guò)程中容易酸化，培養(yǎng)基?pH 值滅菌后會(huì)有所下降，滅菌前培養(yǎng)基的 pH 值偏低可能導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養(yǎng)基可適當(dāng)增加瓊脂或植物凝膠的用量。

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9. 應(yīng)用 75% 的酒精進(jìn)行種子消毒的過(guò)程中需要注意哪些問(wèn)題？

種子在消毒過(guò)程中使用?75% 的酒精應(yīng)慎重，酒精滲透力極強(qiáng)，消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)直接影響種子發(fā)芽率，所以建議消毒時(shí)間不應(yīng)超過(guò)?1 min。

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10. 原始繁殖材料的消毒

組培原始繁殖的外植體消毒，直接影響整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。

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從室外采回來(lái)的外植體需進(jìn)行消毒，首先用自來(lái)水沖洗外植體，沖洗時(shí)間可根據(jù)采集部位不同而定，一般在?5～15 分鐘即可；在超凈臺(tái)中進(jìn)行藥劑的處理，常用的藥劑處理有 70% 的乙醇溶液、9% 的次氯酸鈉溶液和 0.1～0.2% 的升汞溶液，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料而定。應(yīng)注意的是經(jīng)升汞滅菌的外植體必須用無(wú)菌水沖洗?6～8 次。

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11. 怎樣處理植物組織培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的各種污染？

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染來(lái)源主要分為?3 種：真菌、細(xì)菌、組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染源

在操作過(guò)程中，難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上導(dǎo)致污染。不正確操作也會(huì)增加污染幾率。

預(yù)防措施：通風(fēng)、保持室內(nèi)空氣干燥、紫外殺菌等。污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。

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污染原因判斷：

（1）培養(yǎng)基污染?

若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，可確定是人為引起的污染。比如：培養(yǎng)基滅菌不徹底，開瓶時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，滅菌后存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，高溫蒸汽滅菌器的溫度、壓力、時(shí)間沒(méi)有正確設(shè)，過(guò)濾滅菌過(guò)程中濾膜孔徑選擇，過(guò)濾滅菌器的滅菌處理，過(guò)濾滅菌操作等。這些均會(huì)影響培養(yǎng)基的滅菌效果。

措施：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求，滅菌規(guī)程操作。

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（2）外植體污染?

若污染菌類是從材料周圍長(zhǎng)起，且發(fā)生在?5 天以后，則說(shuō)明是材料帶的內(nèi)生菌?？赡苁墙臃N用具滅菌不徹底，接種時(shí)材料被污染；

若從培養(yǎng)基以下開始長(zhǎng)菌，發(fā)生時(shí)間較早，且有從里向外的趨勢(shì)，則說(shuō)明是切口引起的污染，原因可能是未剪去兩個(gè)切口或者雖剪去切口但是所用器具帶菌；或者是未及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過(guò)程中引起交叉污染；

措施：取材時(shí)應(yīng)仔細(xì)選擇，以減少污染的發(fā)生。

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（3）操作環(huán)節(jié)污染?

接種室是否清潔、干燥、密封，是否經(jīng)常用紫外燈照射、甲醛熏蒸、70% 的酒精噴霧殺菌等；超凈工作臺(tái)擺放物品雜亂，長(zhǎng)時(shí)間不換濾網(wǎng)，導(dǎo)致凈化能力降低；接種用具滅菌不徹底引起污染；操作不正確等。

措施：每次接種前半個(gè)小時(shí)，用?20% 的新潔爾擦洗室內(nèi)設(shè)備、工作臺(tái)面，再用紫外燈照射 20 min，噴灑?70% 的乙醇進(jìn)行消毒。除了培養(yǎng)基、接種材料、器具和用具保證無(wú)菌外，同時(shí)在接種時(shí)還需要嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作。

（1）真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經(jīng)高壓滅菌后扔掉；若是細(xì)菌污染，只要及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感染菌的部分剪下轉(zhuǎn)接，材料仍可以用。

（2）用抗生素等殺菌藥劑處理。至今還未發(fā)現(xiàn)哪種抗生素能夠?qū)Ω鞣N菌都有效，并且常影響植物材料的正常生長(zhǎng)分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無(wú)法利用。

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12. 外植體的選擇

為了使接種后的誘導(dǎo)得以成功，選擇的外植體應(yīng)該是幼嫩、處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的，選擇的外植體的體積不能過(guò)小，如若過(guò)小則會(huì)影響愈傷組織的形成，從而影響進(jìn)一步的分化。因此，一般接種的外植體體積在?0.5～1.0 cm2 的范圍內(nèi)即可。最適的為莖尖、帶芽、莖段，也可以利用葉子、子葉、根段、花器官組織等。

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13. 植物莖段組織培養(yǎng)需要注意哪些問(wèn)題

以莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)比較容易，一般取植物的嫩莖切段作為外植體，切成?0.5～1 cm 長(zhǎng)的小段進(jìn)行接種，保證每個(gè)莖段有一個(gè)芽點(diǎn)和一片葉子，將芽點(diǎn)部位以下垂直插入培養(yǎng)基凝膠中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

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14. 外植體接種需要注意的操作事項(xiàng)

接種前首先進(jìn)行滅菌消毒，接種所用的鑷子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高溫高壓滅菌，提前?10 分鐘打開超凈工作臺(tái)，滅紫外 15～20 min，操作人員要用 75% 的酒精棉球擦手、工作臺(tái)和器皿，解剖刀和鑷子等隨時(shí)擦酒精灼燒，晾涼后備用。

在無(wú)菌培養(yǎng)皿或?yàn)V紙上切割外植體，接種到培養(yǎng)基表面，注意瓶口傾斜接近酒精燈火焰。

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15. 組織培養(yǎng)中材料褐化現(xiàn)象

不同品種以及生理狀態(tài)引起的褐化狀態(tài)不同。培養(yǎng)基過(guò)高濃度的無(wú)機(jī)鹽及高水平細(xì)胞分裂素會(huì)使褐化現(xiàn)象加重。培養(yǎng)條件不當(dāng)，例如光照過(guò)強(qiáng)、溫度過(guò)高、培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加重外植體的褐變程度。

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防治措施：

選擇合適的外植體：選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。

合適的培養(yǎng)條件：無(wú)機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。

使用抗氧化劑：在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP 等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用 0.1%～0.5% 的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。

連續(xù)轉(zhuǎn)移：對(duì)容易褐變的材料可間隔?12～24 小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過(guò)連續(xù)處理 7～10 天后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。

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16. 材料玻璃化問(wèn)題

植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明、水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。

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玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥，試管苗生長(zhǎng)緩慢、玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，繁殖系數(shù)有所下降。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

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愈傷組織的玻璃化問(wèn)題主要表現(xiàn)在培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織松散、脆易碎。葉子或是長(zhǎng)出的愈傷一段時(shí)間后在其周圍出現(xiàn)水漬化，繼而影響整個(gè)培養(yǎng)基。

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防治措施:?

在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量及含氮化合物的用量，選用低?NH4 +水平的 B5 培養(yǎng)基，都能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；

增加光照，對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；在培養(yǎng)基中添加活性炭、馬鈴薯汁、間苯三酚等可有效的減輕和防止玻璃化。

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17. 材料水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯

可能原因：表面殺菌劑過(guò)量，消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體選用不當(dāng)（部位或時(shí)期）。

改進(jìn)措施：調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短消毒時(shí)間，試用其他部位，生長(zhǎng)初期取材。

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18. 材料長(zhǎng)期培養(yǎng)幾乎無(wú)反應(yīng)

可能原因：培養(yǎng)基不適合，生長(zhǎng)素的選擇和用量不當(dāng)，植物激素對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和生理過(guò)程的調(diào)節(jié)作用，往往不是某一種植物激素的單獨(dú)效果；環(huán)境溫度不適宜。

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改進(jìn)措施：

更換培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度；

調(diào)整激素的種類與配比，增加生長(zhǎng)素用量，例如使用人工合成的生長(zhǎng)素類似物?2，4 -D 等可有效促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，新器官的分化和形成；

調(diào)整培養(yǎng)溫度等環(huán)境條件。

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19. 愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)旺疏松

可能原因：由于培養(yǎng)基中激素添加過(guò)量，培養(yǎng)室溫度偏高，礦物質(zhì)等無(wú)機(jī)鹽含量不當(dāng)?shù)纫蛩匾鸬摹?/p>

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改進(jìn)措施：根據(jù)不同的品種、不同組織、不同器官，應(yīng)適當(dāng)減少激素用量，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無(wú)機(jī)鹽（尤其是銨鹽）含量，適當(dāng)提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度，避免愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)旺和疏松現(xiàn)象發(fā)生。

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20. 愈傷組織生長(zhǎng)緩慢太緊密

可能原因：細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的用量過(guò)多，糖濃度過(guò)高。

改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例，降低糖濃度。

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21.?愈傷組織分化率低，畸形，分化出的芽多為葉狀芽或叢芽，芽生長(zhǎng)困難，不易成苗。培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)，再次愈傷組織化

可能原因：生長(zhǎng)素用量偏高，溫度偏高。

改進(jìn)措施：減少生長(zhǎng)素用量，可以通過(guò)分化培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中添加?GA3（濃度在 0.5～2 mg/L 之間）解決，并適當(dāng)降低愈傷組織的培養(yǎng)溫度。

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22. 叢生苗過(guò)于細(xì)弱，不適于生根或移栽

可能原因：細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高或赤霉素使用不當(dāng)，產(chǎn)生過(guò)多的不定芽；溫度過(guò)高，光照短，光強(qiáng)不足；不及時(shí)的轉(zhuǎn)移和分切，生長(zhǎng)空間小。

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改進(jìn)措施：

減少細(xì)胞分裂素用量，免用赤霉素；

延長(zhǎng)光照時(shí)間，增強(qiáng)光照；

及時(shí)轉(zhuǎn)接；

降低接種密度；

更換透氣的封口膜等。

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23. 組織培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)黃化

可能原因：培養(yǎng)基中?Fe 的含量不足，各種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不均衡；培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶?jī)?nèi)有害氣體積累（乙烯、氨氣、甲醛）等會(huì)引起植物材料黃化脫落；激素配比不當(dāng)；糖用量不足或長(zhǎng)時(shí)間不轉(zhuǎn)移；pH 值變化過(guò)大；培養(yǎng)溫度不適；光照不足等。

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改進(jìn)措施：

改善組培條件，在配制培養(yǎng)基過(guò)程中檢查儀器設(shè)備是否準(zhǔn)確；

降低組培苗的接種密度，及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物；

使用透氣的封口膜改善瓶?jī)?nèi)通氣狀況；

適當(dāng)調(diào)節(jié)?pH 值、激素配比和無(wú)機(jī)鹽濃度；

控制培養(yǎng)室內(nèi)溫度，適當(dāng)增加光照。

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24. 植物組培培養(yǎng)基都有哪些？

MS 培養(yǎng)基：1962 年穆拉辛格和斯庫(kù)格為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，其中硝酸鹽的濃度高，適合植物原生質(zhì)體、細(xì)胞和組織培養(yǎng)。

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B5 培養(yǎng)基：1968 年甘伯爾格為大豆細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，銨的濃度低。適合木本植物的組織和細(xì)胞培養(yǎng)。

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富鹽平衡培養(yǎng)基：是目前使用最廣泛的一類，特點(diǎn)是：無(wú)機(jī)鹽濃度高，微量元素種類齊全，濃度高；元素間比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖能力、穩(wěn)定性好、營(yíng)養(yǎng)豐富，一般培養(yǎng)時(shí)無(wú)需再加入有機(jī)成分。

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高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有?B5、N6、SH。特點(diǎn)是：硝酸鉀濃度高，氨態(tài)氮濃度低，含有較高濃度的硫胺素（VB1）。

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中鹽培養(yǎng)基：大多是在?MS 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行改良設(shè)計(jì)。特點(diǎn)是：大量元素?zé)o機(jī)鹽為 MS 的一半，微量元素種類減少、含量增高。維生素種類比 MS 增多，例如增加了生物素、葉酸等。

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低鹽培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)成分含量濃度低，多用作生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

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25. 木本植物（油料植物）組織培養(yǎng)中遇到再生苗無(wú)法生根時(shí)怎么辦？

一般常用的?1 / 2MS 或者 1 / 2WPM 基本能夠滿足。如果增殖用的都生產(chǎn)正常，到生根的時(shí)候出現(xiàn)落葉，只能通過(guò)排除法一樣樣分析。

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首先看是不是培養(yǎng)溫度太高，使用瓶蓋后透氣性差，導(dǎo)致乙烯積累。其次，可以適當(dāng)添加少量分裂素，或者更換生長(zhǎng)素，以及多種生長(zhǎng)素混合使用。

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26. 培養(yǎng)基中添加糖類作為碳源物質(zhì)，有何重要作用？

碳源為植物細(xì)胞提供能量來(lái)源，蔗糖較葡萄糖能更好地調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的滲透壓。微生物生長(zhǎng)所需的碳源最常用的是葡萄糖。采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可一定程度上減少微生物的污染。

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生長(zhǎng)素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數(shù)量。

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27. 用于植物原生質(zhì)體制備的材料，以及常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑

用于植物原生質(zhì)體的材料需要選取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，幼嫩的組織。無(wú)菌試管苗的葉片、胚軸及子葉、花藥，以及愈傷組織（懸浮細(xì)胞）等。

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常用的調(diào)節(jié)原生質(zhì)體滲透壓的穩(wěn)定劑主要有甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。滲透壓濃度一般為?0.3～0.8 mol/L。

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28. 組培苗移栽需要注意的問(wèn)題

在移栽前打開三角瓶的封口膜，煉苗?3～5d 后取出小苗，用流水洗凈根部的培養(yǎng)基，然后移栽到盛有滅過(guò)菌的蛭石營(yíng)養(yǎng)缽中過(guò)度一下，但要注意不可直接向營(yíng)養(yǎng)缽中澆營(yíng)養(yǎng)液（容易長(zhǎng)菌），用透明的塑料薄膜罩住小苗 3～5d 后移栽到土里。

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29. 光照強(qiáng)度多少 lux 是如何計(jì)算的

光照強(qiáng)度?= 光通量/單位面積。Lux 的換算比較抽象，一般以燭光為計(jì)算單位，現(xiàn)在所用的以電源發(fā)光的光源，記作國(guó)際燭光，即 25 瓦特的電燈其光強(qiáng)度等于 25 國(guó)際燭光。1 標(biāo)準(zhǔn)燭光 = 10.76 Lux。

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30. LED 光源在植物組織培養(yǎng)中的選擇

光是植物生長(zhǎng)中最重要的環(huán)境因子之一，并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED 光源 460nm 左右的藍(lán)光和 660nm 左右的紅光是植物最需要的光波，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用。

植物組織培養(yǎng)/微繁殖（micropropagation）大體上可以劃分為5個(gè)階段，這樣的階段劃分不僅是對(duì)組培流程的描述，也代表了需要對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行改變的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

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零階段

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母本的選擇和處理?( Stage 0 Mother plant selection adn preparation)。在組培實(shí)驗(yàn)開始前，必須慎重選擇母本材料。母本的品種/物種特性要典型，沒(méi)有任何病害跡象。需要考慮對(duì)母本材料進(jìn)行一定處理，以降低stage 1 的外植體污染率。適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件或化學(xué)試劑處理有可能提升后續(xù)組培階段的生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生和增殖率，例如一定的高溫處理、細(xì)胞分裂素和/或赤霉素的噴施。對(duì)母本可能攜帶的細(xì)菌和病毒進(jìn)行檢測(cè)是商業(yè)化植物組織培養(yǎng)的必要環(huán)節(jié)，但常常被忽略了。

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第一階段?無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立

（Stage ⅠEstablishing an aseptic culture)

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本階段主要是建立起外植體的無(wú)菌培養(yǎng)體系。成功的標(biāo)志是外植體沒(méi)有微生物污染，并且有一定的生長(zhǎng)，例如莖尖的生長(zhǎng)或愈傷組織的形成。本階段通常會(huì)有大量的外植體接種，經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng)應(yīng)該將有污染出現(xiàn)的培養(yǎng)容器丟棄掉，不再繼續(xù)培養(yǎng)。本階段只要獲得目標(biāo)數(shù)量的無(wú)污染，其表現(xiàn)生長(zhǎng)的外植體即可，不需要100%的成功率。

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第二階段?繁殖體的增殖

（Stage Ⅱ?the production of suitable popagules)

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本階段主要目標(biāo)是擴(kuò)增繁殖體的數(shù)量。例如，側(cè)芽的生長(zhǎng)，不定芽的產(chǎn)生，體細(xì)胞胚的形成和微型儲(chǔ)藏器官（塊莖和鱗莖）的形成。本階段產(chǎn)生的繁殖體通常再次進(jìn)入增殖循環(huán)中，以擴(kuò)增到需要的數(shù)量。

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第三階段?移栽前培養(yǎng)?

（Stage?Ⅲ?Preparation for growth in the natural enviroment)

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Stage Ⅱ產(chǎn)生的小苗或者芽（shoots）通常不具備在基質(zhì)中自主生長(zhǎng)的能力。在stage Ⅲ，需要通過(guò)一些培養(yǎng)措施使得這些小苗產(chǎn)生足夠的光合能力。有些植物需要在stageⅢ進(jìn)行特殊處理以避免生長(zhǎng)停滯或休眠。

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生根培養(yǎng)是stage Ⅲ的重要工作。通常需要將芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根。有的情況下，在生根培養(yǎng)前，需要將芽培養(yǎng)到足夠的長(zhǎng)度。為了降低成本，有很多實(shí)驗(yàn)室會(huì)將未生根的芽轉(zhuǎn)出組培瓶外進(jìn)行生根培養(yǎng)。

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第四階段?移栽馴化?

（Stage Ⅳ?Transfer to the natural enviroment)

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本階段為組培苗從組培瓶轉(zhuǎn)入溫室馴化培養(yǎng)。本階段至關(guān)重要，如果操作不當(dāng)，會(huì)造成大量損失。主要的原因有兩個(gè)：

1.?組培苗容易失水死亡。組培苗通常在高濕度和低光強(qiáng)條件下培養(yǎng)，葉片表面的蠟質(zhì)未形成。組培苗的氣孔在遇到濕度降低時(shí)可能不會(huì)閉合。以上原因會(huì)導(dǎo)致組培苗在移栽后迅速失水死亡。

2.?組培苗以蔗糖為碳源且處于低光強(qiáng)下，光合能力較弱。如果在移栽后短時(shí)間內(nèi)不能形成光合能力，也會(huì)出現(xiàn)死亡。

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通常組培苗從組培容器中取出后需要洗凈根上的瓊脂，轉(zhuǎn)入移栽基質(zhì)中。在馴化早期，需要高濕度和低光強(qiáng)的條件，隨后逐漸減低濕度和增加光強(qiáng)，直到適應(yīng)溫室環(huán)境。

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植物組織培養(yǎng)的階段劃分最早是Murashige教授提出的三階段劃分（即stageⅠ，Ⅱ和Ⅲ），這一劃分方案也被廣泛的認(rèn)同和采用。后續(xù)stage 0 和stage Ⅳ的增加使得這個(gè)體系更加完整。按照這個(gè)階段劃分去設(shè)計(jì)和優(yōu)化組培方案，對(duì)實(shí)際工作是有幫助的。

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植物組織培養(yǎng)的條件

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1、植物組織培養(yǎng)的整個(gè)操作和培養(yǎng)過(guò)程都要求在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，無(wú)菌是組織培養(yǎng)成功的首要條件。操作過(guò)程在接種室內(nèi)超凈工作臺(tái)上進(jìn)行；外植體材料要進(jìn)行表面消毒；配制的培養(yǎng)基要進(jìn)行高壓滅菌消毒。

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2、溫度處理操作和培養(yǎng)過(guò)程都是在恒溫條件下進(jìn)行，一般在23—27℃之間，熱帶植物可偏高些，脫毒植物需要高溫處理。

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3、光照處理植物的器官必須有光，某些植物器官的生成是在無(wú)光條件下，但它的生長(zhǎng)和發(fā)育必須有光。莖尖的生長(zhǎng)及試管苗的繼代增殖以3000-5000lux光照強(qiáng)度適宜；生根試管苗以3000lux適宜。光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、器官的分化有不同的影響。光周期誘導(dǎo)一般是16h，黑暗是12h，對(duì)光周期敏感植物要掌握光照時(shí)間，否則影響植物的分化。

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培養(yǎng)基的酸堿度因植物的種類不同而有區(qū)別，大多數(shù)植物要求在5.8之間，喜酸性培養(yǎng)的植物要求的酸堿度較嚴(yán)格。

組培應(yīng)用前景

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1．快速繁殖某些稀有植物或有較大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，依靠自然條件在較短時(shí)間內(nèi)繁殖稀有植物和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的植物，受到地理環(huán)境和季節(jié)的限制，很難達(dá)到快速、高效的目的；特別對(duì)于在短時(shí)期內(nèi)需要達(dá)到一定數(shù)量，才能創(chuàng)造應(yīng)有價(jià)值的植物，時(shí)間就是效益，只有通過(guò)組織培養(yǎng)的方法才能滿足這一要求。

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用組織培養(yǎng)法繁殖植物，這是組織培養(yǎng)應(yīng)用于生產(chǎn)的主要的和成效最大的實(shí)例。首先是在蘭花上的成功應(yīng)用。自Morel在1960年得到蘭花組織培養(yǎng)苗后，很快應(yīng)用于生產(chǎn)，形成了組織培養(yǎng)法繁殖蘭花工業(yè)。

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由于組織培養(yǎng)法繁殖植物的明顯特點(diǎn)是快速，每年可以數(shù)以百萬(wàn)倍速度繁殖，因此對(duì)一些繁殖系數(shù)低，不能用種子繁殖的名特優(yōu)植物品種的繁殖，尤為意義重大。

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2、脫毒?植物中有很多都帶有病毒，嚴(yán)重影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)業(yè)帶來(lái)災(zāi)害。特別是無(wú)性繁殖植物，如馬鈴薯、草莓、大蒜、康乃馨等，由于病毒是通過(guò)維管束傳導(dǎo)的，因此利用這些植物營(yíng)養(yǎng)器官繁殖，就會(huì)把病毒帶到新的植物個(gè)體上而發(fā)生病害。但是也證明感病植株并不是每個(gè)部位都帶有病毒，如莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)尚未分化成維管束的部分，可能不帶病毒。若利用組織培養(yǎng)法進(jìn)行莖尖培養(yǎng)，再生的植株有可能不帶病毒，從而獲得脫病毒的苗，再用這種苗進(jìn)行繁殖，則種植的植物就不會(huì)或極少發(fā)生病毒病。

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所獲得的脫毒苗一定要經(jīng)過(guò)鑒定，確認(rèn)不帶病毒才能使用。使用組織培養(yǎng)法獲得脫毒苗已經(jīng)在草莓、葡萄、康乃馨等獲得成功，產(chǎn)生明顯的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。

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3、植物種質(zhì)資源的保存、挽救瀕于滅絕的植物?長(zhǎng)期以來(lái)人們想了很多方法來(lái)保存植物，如儲(chǔ)存果實(shí)，儲(chǔ)存種子，儲(chǔ)存塊根、塊莖、種球、鱗莖；用常溫、低溫、變溫、低氧、充惰性氣體等，這些方法在一定程度上收到了好的或比較好的效果，但仍存在許多問(wèn)題。主要問(wèn)題是付出的代價(jià)高，占的空間大，保存時(shí)間短，而且易受環(huán)境條件的限制。植物組織培養(yǎng)結(jié)合超低溫保存技術(shù)，可以給植物種質(zhì)保存帶來(lái)一次大的飛躍。因?yàn)楸４嬉粋€(gè)細(xì)胞就相當(dāng)于保存一粒種子，但所占的空間僅為原來(lái)的幾萬(wàn)分之一，而且在-193度的液氮中可以長(zhǎng)時(shí)間保存，不像種子那樣需要年年更新或經(jīng)常更新。

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環(huán)境的不斷變化使許多種類的植物面臨著滅絕的危險(xiǎn)，而且許多種植物已經(jīng)滅絕，留給人類的只是一種遺憾。如何挽救這些植物，還有許許多多的動(dòng)物，已成為世人關(guān)注的問(wèn)題。實(shí)踐證明，通過(guò)組織培養(yǎng)的方法可以使一部分瀕危的植物種類得到延續(xù)和保存；如果在結(jié)合超低溫保存技術(shù)，就可以使這些植物得到較為永久性的保存。其實(shí)，對(duì)大多數(shù)普通植物來(lái)說(shuō)，用組織培養(yǎng)的方法保存其種質(zhì)材料，也具有十分重要的意義。因?yàn)?，人們現(xiàn)在無(wú)法預(yù)知哪些植物會(huì)面臨滅頂之災(zāi)，或許今天看似繁茂的植物，明天就可能被沙漠、洪水、大火或戰(zhàn)爭(zhēng)吞沒(méi)。

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4、通過(guò)花藥和花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株、縮短育種年限?通過(guò)花藥和花粉組織培養(yǎng)可以獲得單倍體植物，大大縮短了育種時(shí)間。使新品種的培育過(guò)程大大簡(jiǎn)化

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5、胚胎培養(yǎng)的應(yīng)用?在遠(yuǎn)源雜交中，雜交后形成的胚珠往往在未成熟狀態(tài)時(shí)，就停止生長(zhǎng)，不能形成有生活力的種子，因而雜交不孕，這給遠(yuǎn)緣雜交造成極大困難。十九世紀(jì)二十年代末，Laibach用胚培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)亞麻種間雜種胚，第一個(gè)獲得了雜種植物，這一成功為在遠(yuǎn)緣時(shí)克服雜交不親和的障礙提供了一項(xiàng)有用的技術(shù)。

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這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)相當(dāng)成熟，可以說(shuō)多數(shù)植物的成熟或未成熟胚通過(guò)培養(yǎng)都可獲得成功。幼胚培養(yǎng)已經(jīng)可使5個(gè)細(xì)胞大小的極幼齡的胚狀結(jié)構(gòu)培養(yǎng)成植株。但胚珠培養(yǎng)的研究不多，單個(gè)胚珠培養(yǎng)尚存在許多問(wèn)題，需作深化研究。

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遠(yuǎn)緣雜交中，由于生理上和遺傳上的障礙而不能雜交成功，可采用試管受精加以克服，即將母本胚珠離體培養(yǎng)，使異種花粉在胚珠上萌發(fā)受精，產(chǎn)生的雜種胚在試管中發(fā)育成完整植株。

用胚乳培養(yǎng)可獲得三倍體植株，為誘導(dǎo)形成三倍體植物開辟了一條新途徑。三倍體加倍后得到六倍體，可育成多倍體品種。

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6、細(xì)胞融合通過(guò)原生質(zhì)體融合，可部分克服有性雜交不親和性，而獲得體細(xì)胞雜種，從而創(chuàng)造新種或育成優(yōu)良品種。

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7、培養(yǎng)細(xì)胞突變體的應(yīng)用?培養(yǎng)細(xì)胞處在不斷分生狀態(tài)，它就容易受培養(yǎng)條件和外加壓力（如射線、化學(xué)物質(zhì)）的影響而產(chǎn)生突變，從中可以篩選出有用的突變體，從而育成新品種。目前用這種方法已經(jīng)篩選到抗病、抗鹽、高蛋白、高產(chǎn)等突變體，有些已經(jīng)用于生產(chǎn)。

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8、用于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、胚胎學(xué)、基因工程、生物工程等研究要揭開生命活動(dòng)的秘密，需要多科學(xué)、多技術(shù)的相互配合，其中植物組織培養(yǎng)技術(shù)是不可缺少的，它為遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物工程等提供了一種有效、快速的方法。因?yàn)橐沂旧膴W秘，首先要研究單個(gè)基因的作用，研究它在細(xì)胞內(nèi)是如何組裝的，如何與其它基因發(fā)生聯(lián)系，如何表達(dá)和調(diào)控等。分離單個(gè)基因，對(duì)它DNA進(jìn)行測(cè)序，再對(duì)其中的某些堿基實(shí)行突變，然后還需要將基因送到受體細(xì)胞當(dāng)中，看表達(dá)情況，以確定其功能。接受基因的受體細(xì)胞要產(chǎn)生再生植株，就需要通過(guò)組織培養(yǎng)的方法才能實(shí)現(xiàn)。

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9、利用組織培養(yǎng)的材料作為植物生物反應(yīng)器中國(guó)的中草藥是一份人類寶貴的財(cái)富，但很多種中草藥資源匱乏，產(chǎn)量不足，甚至瀕于滅絕。如果能利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)的方法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生產(chǎn)，不再依附于自然環(huán)境，不僅可以解決現(xiàn)有困難，而且可以通過(guò)篩選高產(chǎn)有效成分的細(xì)胞系，來(lái)提高其藥用價(jià)值。比如用培養(yǎng)的人參懸浮細(xì)胞，來(lái)生產(chǎn)人參皂苷，已在日本等國(guó)家形成規(guī)模。利用培養(yǎng)的植物細(xì)胞和組織細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，也可以生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生產(chǎn)乙肝疫苗正在實(shí)驗(yàn)中。

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10、用于其它未知科學(xué)的研究?現(xiàn)代科學(xué)發(fā)展非常迅速，很多現(xiàn)在預(yù)想不到的事情都有可能發(fā)生，新發(fā)明、新發(fā)現(xiàn)、新創(chuàng)造層出不窮，今天認(rèn)為不可能的東西明天就可能變成現(xiàn)實(shí)。植物組織培養(yǎng)也同樣具有許多尚未發(fā)掘出的潛力，說(shuō)不定有一天人們會(huì)在三角瓶?jī)?nèi)種出大南瓜。

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什么是組織培養(yǎng)（組培）

組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)和制約因素

組織培養(yǎng)的條件和培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)

MS 培養(yǎng)基的配方及特點(diǎn)

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室（組培室）規(guī)劃設(shè)計(jì)的原則及要求

組培工廠籌建的注意事項(xiàng)

組培室凈化的標(biāo)準(zhǔn)和要求

組培中污染產(chǎn)生的原因及防治措施

組培室培養(yǎng)過(guò)程

LED可調(diào)光生長(zhǎng)燈（動(dòng)態(tài)光配方）

光照對(duì)植物的作用

組培苗的煉苗

煉苗

植物無(wú)糖組織培養(yǎng)

組培科研（生產(chǎn)）常用的光照培養(yǎng)架

組培儀器設(shè)備——臥式矩形滅菌器

組培儀器設(shè)備——風(fēng)淋室

組培室儀器設(shè)備——超凈工作臺(tái)

愈傷組織形態(tài)發(fā)生的調(diào)控

組培生產(chǎn)的要點(diǎn)

植物組培——初代培養(yǎng)

組培苗的壯苗與培養(yǎng)

愈傷組織的培養(yǎng)及外植體的選擇與培養(yǎng)

光合作用與生長(zhǎng)發(fā)育的影響因素

組培室功能區(qū)分和常用的器材功能

無(wú)糖組織培養(yǎng)

組培中的細(xì)菌污染與真菌污染

LED植物生長(zhǎng)燈

不同植物L(fēng)ED生長(zhǎng)燈的光質(zhì)配比

生姜的組織培養(yǎng)