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谷氨酸（Glu）是脊椎動(dòng)物大腦中含量最豐富的神經(jīng)遞質(zhì)之一。以細(xì)菌周質(zhì)結(jié)合蛋白（PBP）為骨架開發(fā)的iGluSnFR及其變體已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)Glu監(jiān)測。然而，常用的iGluSnFR及其變體無法區(qū)分突觸和突觸外的谷氨酸信號，如iGluSnFR、sf-iGluSnFR和SF-Venus-iGluSnFR監(jiān)測谷氨酸信號空間范圍均大于平均突觸間距。

因此，我們需要一種全新方法，以區(qū)分突觸和突觸外的Glu信號。

美國霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所Kaspar Podgorski 課題組通過多重分析篩選，開發(fā)了具有突觸信號特異性、改進(jìn)動(dòng)力學(xué)和信噪比的新變體iGluSnFR3.v857，并將其上傳至預(yù)印本平臺“Glutamate indicators with improved activation kinetics and localization for imaging synaptic transmission” 一文中。

圖1. DOI：10.1101/2022.02.13.480251

iGluSnFR3.v857的特征in vitro

首先，作者及其團(tuán)隊(duì)選擇SF-Venus-iGluSnFR-A184V（WT）作為模板，通過20輪誘變和篩選，確定了最優(yōu)變體iGluSnFR3.v857（15個(gè)突變vs WT）。

1）更高敏感性：

相較于WT和iGluSnFR3.v82變體，在1、5、10、20和160個(gè)動(dòng)作電位（AP）刺激時(shí)，iGluSnFR3.v857激發(fā)亮度更高（圖2b）。同時(shí)，刺激后iGluSnFR3.v857上升速度更快（圖2c）、信噪比更高（圖2e）。

圖2. 體外培養(yǎng)神經(jīng)元中iGluSnFR3.v857的特性

2）更好的線性：

反應(yīng)速率常數(shù)（kobs）的停流測量顯示W(wǎng)T和iGluSnFR3變體的不同程度的飽和動(dòng)力學(xué)，其中iGluSnFR3.v857更接近線性。

圖3. WT及iGluSnFR3變體的反應(yīng)速率

由于突觸釋放的概率，以及由此釋放的囊泡的平均數(shù)量，取決于細(xì)胞外Ca2+。使用iGluSnFR3.v857，當(dāng)胞外Ca2+濃度從1.3 mM增加到3.5 mM時(shí)，單軸突終末1 AP的ΔF/F明顯增加；而相同條件下，WT作用的單軸突終末反應(yīng)沒有明顯增加。這與該指標(biāo)的飽和動(dòng)力學(xué)結(jié)果一致。

圖4. WT及iGluSnFR3變體對鈣離子濃度的響應(yīng)

3）更優(yōu)的空間特異性

破傷風(fēng)毒素輕鏈肽（TeNT）可介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的突觸前抑制。給予1AP刺激后，iGluSnFR3.v857+TeNT共表達(dá)神經(jīng)元中信號，較單獨(dú)表達(dá)v857大幅降低（圖4h右）。而表達(dá)WT+TeNT神經(jīng)元信號則較單獨(dú)表達(dá)A184V神經(jīng)元上升（圖4h左）。這說明iGluSnFR3.v857能夠更好區(qū)分突觸和突觸外Glu。

iGluSnFR3.v857改善了突觸后的納米級定位

SnFR 探針家族通過N端插入IgΚ分泌先導(dǎo)序列和C端PDGFR跨膜結(jié)構(gòu)域之間而實(shí)現(xiàn)膜定位。因此，作者比較了v857與其他15個(gè)C端突變的納米定位情況。其中兩個(gè)GPI錨定蛋白（GPICOBL9，GPINGR）和一個(gè)Stargazin（SGZ）變體顯著增加了SNR、改善了表面轉(zhuǎn)運(yùn)。

隨后將這些變體通過AAV傳遞至小鼠皮質(zhì)，并通過GFP、Bassoon和Homer1抗體對突觸前膜和突觸后膜進(jìn)行標(biāo)記。共定位結(jié)果顯示，對于所有變體，抗GFP標(biāo)記在膜內(nèi)的分布是不均勻的，并且在整個(gè)樹突中出現(xiàn)了標(biāo)記間隙（圖5c），但可清楚地觀察到v857對突觸后的良好標(biāo)記（圖5d）。

圖5. v857的樹突和突觸免疫標(biāo)記成像

iGluSnFR3.v857活體成像

接下來，作者在小鼠視覺皮層中進(jìn)

行了iGluSnFR3.v857的活體表征，通過在體熒光成像和電生理驗(yàn)證了上述結(jié)果。結(jié)果顯示，與表達(dá)SF-iGluSnFR.A184S的神經(jīng)元相比，表達(dá)v857的神經(jīng)元的突觸表現(xiàn)出更大、更快的1AP相關(guān)的瞬態(tài)（圖6c,d）。同時(shí)，與A184S相比，v857在與AP相關(guān)的瞬態(tài)和非AP相關(guān)的事件之間表現(xiàn)出更大的差異（圖6e）。剔除成像測量噪聲后，上述結(jié)果依然顯著（圖6f）。
小鼠運(yùn)動(dòng)刺激實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也與上述描述一致。v857報(bào)告的方向調(diào)諧反應(yīng)更多定位在樹突棘上，其振幅明顯大于SF-iGluSnFR.A184S（圖6i,j,k）。

圖6. 在視覺皮層的體內(nèi)雙光子谷氨酸成像和電生理學(xué)

iGluSnFR3.v857完美響應(yīng)精確定時(shí)的突觸活動(dòng)

最后，作者驗(yàn)證了這種探針對“困難模式”（跨腦區(qū)信號傳遞、深腦區(qū)、重復(fù)輸入的時(shí)間滯后）突觸活動(dòng)的響應(yīng)。
結(jié)果顯示，v857.GPI對皮質(zhì)棘突的標(biāo)記與TC突觸的標(biāo)記同樣強(qiáng)烈。這說明v857對深腦區(qū)、跨腦區(qū)信號傳遞同樣具有高效性。作者還記錄了棘突的反應(yīng)，它主要反映重復(fù)項(xiàng)信號輸入。通過空間頻率分析（圖7g）和直接比較平均反應(yīng)時(shí)間（圖7h），棘突反應(yīng)顯示了特征性的滯后，不同突觸對之間的差異高達(dá)70ms。
在不同個(gè)體上重復(fù)這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與上述一致，在L4內(nèi)的平均延遲為17ms。在丘腦腹后核（VPM）標(biāo)記的小鼠中，密集的軸突網(wǎng)絡(luò)沒有一組異質(zhì)的時(shí)間滯后。這說明v857能夠幫助分辨重復(fù)信號輸入的時(shí)間差，也進(jìn)一步證明了v857對體內(nèi)突觸與突觸外信號的高特異性。

圖7. 兩個(gè)選定的活躍棘突的熒光信號的交叉及其時(shí)間序列

總 結(jié)

通過改造，iGluSnFR3.v857提高了在體外和體內(nèi)的敏感性、信噪比、線性和空間特異性，顯示了突觸后的納米定位。
這使以前不可行的研究成為可能。v857有望補(bǔ)充或取代樹突Ca2+成像，以記錄空間分辨的突觸輸入模式。同時(shí)，v857還解決了單個(gè)輸入之間幾毫秒的時(shí)間差異。這些能力對于研究神經(jīng)元計(jì)算和學(xué)習(xí)背后的突觸動(dòng)力學(xué)很有價(jià)值。