肺泡是我們的呼吸系統(tǒng)的最終末結(jié)構(gòu)，主要作用是氧氣和二氧化碳的氣體交換，是人體呼吸作用的重要場所。肺部的結(jié)構(gòu)是非常復雜的，很多呼吸系統(tǒng)疾病都是因為肺泡組織遭到侵染，最終危及生命，比如重癥新型冠狀病毒肺炎，肺纖維化 (IPF) 和慢性阻塞性肺病 (COPD)等等。盡管肺泡如此重要，但是由于肺泡細胞組織獲取困難以及肺泡細胞培養(yǎng)技術不成熟，使我們對人的肺泡以及上述疾病機理的了解不夠深入。

過去很長時間，人終末肺泡區(qū)域被認為由兩種上皮細胞組成，1型肺泡上皮細胞（AT1）和2型肺泡上皮細胞（AT2)。其中AT2細胞被認為是區(qū)域性干細胞或祖細胞，損傷修復時可以自我增殖和分化成AT1細胞。后來，科學家們又在小鼠中發(fā)現(xiàn)了其它種類的終末氣道干細胞，但由于小鼠和人肺的結(jié)構(gòu)存在很大差異，在解剖學上兩者連接的區(qū)域截然不同，因此小鼠模型里獲取的信息并不完全適用于人（圖1）。

近年來，單細胞測序技術和體外干細胞的類器官培養(yǎng)技術的大力發(fā)展，讓科學家們對人肺泡中的細胞譜系有了更深入的了解。最近，Nature背靠背發(fā)表了兩篇關于人肺干祖細胞新譜系的力作，通訊作者分別為賓夕法尼亞大學的Edward E. Morrisey和杜克大學的Purushothama Rao Tata。兩篇文章的相似之處都是先用單細胞測序發(fā)現(xiàn)了人肺的新細胞譜系，然后用類器官體外培養(yǎng)方法進一步證明了新譜系的生態(tài)軌道。

Morrisey通過類器官模型發(fā)現(xiàn)一種獨特的在人體中存在而小鼠中不存在的新型細胞——呼吸道分泌細胞（respiratory airway secretory, RAS）,其能夠充當AT2的單向性祖細胞，這種譜系分化受到Notch和Wnt信號傳導的調(diào)節(jié)。在COPD中，RAS轉(zhuǎn)錄及AT2細胞的狀態(tài)異常，并與人類和雪貂的吸煙暴露相關。

通過對來自五名健康非吸煙者供體的顯微解剖肺組織scRNA-seq分析，Morrisey團隊觀察到遠端肺組織的兩個表達典型標記SCGB1A1的分泌細胞群，其中一群還表達高水平的SCGB3A2，兩群細胞表現(xiàn)出不同的基因表達譜，而SCGB3A2+細胞幾乎不在近端氣道中表達（RAS細胞）。進一步通過基于模型的單細胞轉(zhuǎn)錄組學（MAST）對SCGB1A1+分泌細胞、RAS細胞和AT2細胞進行基因表達分析，該團隊發(fā)現(xiàn)RAS可能作為AT2的祖細胞。

接下來，該團隊使用SCGB3A2-mCherry人胚胎干 (hES) 細胞報告系，利用它可以產(chǎn)生SCGB3A2+人氣道上皮細胞來評估RAS細胞和AT2細胞之間的關系。在氣道培養(yǎng)基中，iRAS可以維持SCGB3A2的表達，當轉(zhuǎn)入肺泡培養(yǎng)基時，SCGB3A2表達迅速下調(diào)，參與AT2細胞成熟的SFTPC啟動表達。如果把AT2重新轉(zhuǎn)移到氣道培養(yǎng)基中，并未激活SCGB3A2表達，說明這是一個單向分化的過程。

為了確定RAS-AT2軸是否在COPD中被破壞，該團隊對一組接受肺移植的COPD患者的外周肺組織進行了scRNA-seq分析，在COPD肺中存在兩個未出現(xiàn)在正常供體數(shù)據(jù)集中的AT2細胞簇，其中一個高表達SCGB3A2。對一組在過去一年內(nèi)是活躍吸煙者或已停止使用煙草的患者進行分析發(fā)現(xiàn)，SCGB3A2+LAMP3+（AT2標記）細胞的百分比隨吸煙指數(shù)的增加而增加。對是否暴露于香煙煙霧中6個月的雪貂的遠端肺進行IHC分析也同樣顯示，SCGB3A2+LAMP3+雙陽性細胞數(shù)量在暴露組中增加。這些數(shù)據(jù)表明，COPD中RAS細胞向AT2細胞分化的功能存在障礙（圖2）。

Tata的文章利用顯微解剖遠端氣道的空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞分析，確定并描述了之前從未被表征過的分子上不同的3種TRB細胞類型—氣道相關的LGR5+成纖維細胞、TRB特異性肺泡0型 (AT0) 細胞和TRB 分泌細胞 (TRB-SC)，同時揭示了驅(qū)動雙能AT0細胞狀態(tài)分化為正?；虿±頎顟B(tài)的機制，不僅修正了人類肺細胞圖譜和譜系軌跡，而且提示了靈長類肺部再生和疾病中的上皮過渡狀態(tài)。

為了在分子和空間上建立人類氣道細胞圖譜，研究人員同時采用了兩種方法（圖3）。首先，使用Visium技術對肺部切片進行了空間轉(zhuǎn)錄組（ST）分析；其次，從周圍組織顯微解剖遠端氣道（直徑小于1毫米并與肺泡相鄰），分離后，進行單細胞轉(zhuǎn)錄組分析。將聚類的18個不同的上皮細胞聚類根據(jù)SFTPB表達的存在與否分為兩個不同的群體，即SFTPB-群體（不表達）和SFTPB+群體（表達）。將這些基因的表達模式與ST數(shù)據(jù)進行直接比較，并綜合分析單細胞RNA測序（scRNA-seq）和ST數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示SFTPB-群體標記物與近端氣道相關，而SFTPB+群體的標記物則存在于遠端氣道。此外，SFTPB-和SFTPB+群體標記物的表達模式將氣道分隔成四個組織學上不同的區(qū)域，而且一些屬于SFTPB+群體和位于TRB的細胞類型在以往研究的健康人類肺部scRNA-seq數(shù)據(jù)中并不存在。以此確定了之前尚未在人類氣道中被表征過的區(qū)域特異性標志物和細胞類型。

隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)了共表達SFTPB但在SCGB1A1、FOXJ1、SCGB3A2和SFTPC表達上不同的上皮細胞類型，進一步的分析表明，這些細胞類型中的每一種都顯示出遠端氣道內(nèi)的特定定位模式。第一類是表達SFTPB和SCGB3A2但缺乏SCGB1A1、FOXJ1和SFTPC的細胞群，是TRB特有的，稱為TRB分泌細（TRB-SC）；第二類是SFTPB+SCGB3A2+SCGB1A1+?的細胞，位于末端細支氣管近端的遠端氣道，稱為末端細支氣管前分泌細胞（pre-TB-SC）；第三類以SFTPB、SCGB3A2和SFTPC的表達為特征，與呼吸性細支氣管相鄰的肺泡間隔有關，在遠端肺泡囊中很少見，由于這些細胞與典型肺泡上皮細胞（肺泡1型和肺泡2型細胞）具有相似的轉(zhuǎn)錄譜和定位，被稱為肺泡0型上皮細胞（AT0）；第四類，是一種分泌纖毛的“混合”細胞類型，其特征是SCGB3A2、SFTPB和FOXJ1的共表達，稱為SCGB3A2纖毛細胞 (SCGB3A2-CC)。此外，研究人員還觀察到四種類型的基底細胞群，通過比較離體遠端和近端氣道上皮細胞的表型特性，最終確定了人類肺中分子、空間和表型不同的基底細胞亞群。

研究人員將scRNA-seq數(shù)據(jù)中的成纖維細胞與之前描述的人類肺參考數(shù)據(jù)集進行比較與注釋，除了已被確定的7類細胞聚類，本文研究人們還發(fā)現(xiàn)了一類特有的成纖維細胞群——LGR5+?成纖維細胞，表現(xiàn)出獨特的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖4）。隨后遠端基底細胞的共培養(yǎng)實驗證實，位于遠端氣道中的LGR5+?成纖維細胞可以支持鄰近基底細胞的生長并維持其分子特征，表明LGR5+?成纖維細胞可作為遠端氣道上皮細胞的生態(tài)位。

進一步地，研究人員利用計算機模擬預測，并經(jīng)過類器官模型驗證，發(fā)現(xiàn)AT2可首先轉(zhuǎn)化為AT0，然后AT0在EGF缺失時轉(zhuǎn)化為TRB-SC（TRB-SC組織成類似于人類肺部病理狀態(tài)下的細支氣管化結(jié)構(gòu)的三維上皮囊腫），或者在添加血清后轉(zhuǎn)變?yōu)锳T1。與此同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)，AT0細胞和TRB-SC在靈長類動物中是保守的，并在人類肺發(fā)育過程中是動態(tài)出現(xiàn)的。使用非人類靈長類動物肺損傷模型，結(jié)合急性肺損傷和IPF患者的組織標本，研究人員發(fā)現(xiàn)AT0主要分布在輕度纖維化區(qū)域，這些區(qū)域與正常AT2區(qū)域相鄰并散布在它們之間，提示AT2正向AT0過渡；相比之下，TRB-SC樣細胞大多出現(xiàn)在類似于“細支氣管化區(qū)域”的經(jīng)典組織學描述的嚴重的纖維化區(qū)域（圖5）。由此表明AT2可以獲得雙能AT0細胞狀態(tài)，并依據(jù)周圍環(huán)境而轉(zhuǎn)變?yōu)锳T1或TRB-SC。

更多的人呼吸道和肺的細胞譜系以及生態(tài)軌跡的發(fā)現(xiàn)將會為理解呼吸疾病的病理改變、體外疾病建模及藥物研發(fā)提供更多理論基礎和應用的可能性。Nature上這兩篇背靠背發(fā)表的文章包含了豐富的原始數(shù)據(jù)，在人肺泡領域的研究中具有里程碑的意義。