（一）簡(jiǎn)單染色法

? ? ? ? 簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。它適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，因?yàn)椋涸谥行浴A性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶有負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此，堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更容易于識(shí)別。常用做染色的染料有：美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。

（二）革蘭氏染色

? ? ? ? 革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。

? ? ? ? 該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅（沙黃、堿性復(fù)紅）復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后因?yàn)槊撍炊闺木厶菍拥目讖娇s小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。

（三）普通顯微鏡

? ? ? ? 普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像，故又常被稱為復(fù)式顯微鏡。它們由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學(xué)顯微鏡通常配置的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最大。使用油鏡時(shí)，需在載玻片與鏡頭之間加滴油，原因（1）.增加照明亮度。（2）.增加顯微鏡的分辨率。

油鏡使用的原理:

? ? ? ?油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過(guò)玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。

實(shí)驗(yàn)方法:

（一）細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色

1. 涂片：

? ? ? ?于潔凈的載玻片上滴一滴無(wú)菌水，蘸取菌種均勻涂布，涂成極薄的菌膜；

2. 固定：

? ? ? ?手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過(guò)微火3次，此操作過(guò)程稱熱固定，其目的是殺死細(xì)菌，使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。待玻片冷卻再加染色液；

3. 染色：

? ? ? ? 滴加一滴結(jié)晶紫染色液于菌膜部位，染色1分鐘；

4. 水洗

? ? ? ? ?傾去染色液，用自來(lái)水自玻片一段緩緩流向另一端，沖去染色液，沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色為止；

5. 干燥

? ? ?自然干燥或把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過(guò)高) ，或者用吸水紙蓋在涂片部位以吸去水分；

（二）細(xì)菌的革蘭氏染色

1.制片（與簡(jiǎn)單染色相同）

（1）涂菌：于潔凈的載玻片上滴一滴無(wú)菌水，蘸取菌種均勻涂布，涂成極薄的菌膜；

（2）固定：目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片膜向上，通過(guò)火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。

2.初染

①初染：于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料；

②媒染：滴加盧戈氏碘液，lmin后水洗；

③脫色：滴加95%乙醇脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止 (根據(jù)涂片之厚薄需時(shí)30s至lmin)，水洗；

④復(fù)染：滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染lmin，水洗。

3.干燥

? ? ? ?自然干燥或把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過(guò)高) ，或者用吸水紙蓋在涂片部位以吸去水分。

（三） 顯微鏡的使用

① 顯微鏡的準(zhǔn)備；

②放置標(biāo)本：將染色的涂片至于鏡臺(tái)上,先用低倍鏡（ 10倍鏡）尋找合適的視野;

③找合適的視野：轉(zhuǎn)動(dòng)粗細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，橫、縱移動(dòng)手柄和調(diào)節(jié)光圈大小，將觀察部位移至視野中央，直至看到清楚的圖像；

④加油柏油：從雙層瓶中取香柏油加到菌膜位置，

⑤調(diào)焦：轉(zhuǎn)換油鏡（ 100倍鏡）至工作位置，要使物鏡浸入香柏油；轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋和調(diào)節(jié)光圈大小直至找到清晰物象。

⑥觀察：仔細(xì)觀察細(xì)菌形態(tài)，描繪細(xì)菌形態(tài)。（四）顯微鏡使用完畢后的處理

① 下降鏡臺(tái)，取下玻片；

② 清潔油鏡：先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用蘸少許二甲苯擦鏡紙擦掉殘留的香柏油，最后用干凈的擦鏡紙擦掉殘留的二甲苯。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。

③ 用擦顯微鏡的擦鏡紙將看后的染色玻片擦干凈。

實(shí)驗(yàn)方法:

（一）細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色

1.涂片

點(diǎn)燃酒精燈，灼燒接種環(huán)，灼燒錐形瓶口，取一環(huán)無(wú)菌水，把水點(diǎn)到載玻片上，灼燒接種環(huán)，灼燒培養(yǎng)皿，冷卻接種環(huán)，蘸取單菌落，把菌點(diǎn)放到玻片上水中

?。?！注意：若沒(méi)有涂抹開(kāi)，菌都堆在一起，看不到單細(xì)胞，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

2.固定

3.染色

把已涂片固定的載玻片放到吸水紙上

吸取結(jié)晶紫染液

滴加一滴結(jié)晶紫染色液于菌膜部位

染色一分鐘

4.水洗

①用自來(lái)水自玻片一段緩緩流向另一端

②沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色為止

5.干燥

(二) 細(xì)菌的革蘭氏染色（Schaeffer-Fulton氏染色法）

1.制片

①涂菌

點(diǎn)燃酒精燈，灼燒接種環(huán)，灼燒錐形瓶口，取一環(huán)無(wú)菌水，把水點(diǎn)到載玻片上，灼燒接種環(huán)，灼燒培養(yǎng)皿，冷卻接種環(huán)，蘸取單菌落，把菌點(diǎn)到載玻片上水中。

！??！注意：若沒(méi)有涂抹開(kāi)，菌都堆在一起，看不到單細(xì)胞，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

②固定

2.染色

①初染

*滴加一滴結(jié)晶紫染色液于菌膜部位染色1min

*用自來(lái)水自玻片一段緩緩流向另一端

*沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色為止

*用吸水紙吸掉多余水分

③媒染

*滴加盧戈氏碘液，媒染1min

*用自來(lái)水自玻片一段緩緩流向另一端

*沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色為止

*滴上95%乙醇

*搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止脫色30s

－1min

*倒掉多余乙醇

*沖洗至流下的水中無(wú)染色液的顏色為止

*吸除多余水分

④復(fù)染

⑤干燥

（內(nèi)容同上）

（三）顯微鏡的使用

（1）顯微鏡的準(zhǔn)備

（2）放置標(biāo)本

（3）找到合適的視野

10倍鏡下的觀察:調(diào)整亮度，調(diào)整載物臺(tái)高度，調(diào)整粗準(zhǔn)焦螺旋，調(diào)整光圈大小，調(diào)整細(xì)準(zhǔn)焦螺旋直至看到清楚的圖像將觀察部位移至視野中央觀察。

（4）加香柏油

*轉(zhuǎn)換物鏡轉(zhuǎn)換器

*40倍鏡下滴加香柏油加到菌膜位置，轉(zhuǎn)換油鏡至工作位置。

（5）調(diào)焦

（6）觀察

仔細(xì)觀察細(xì)菌形態(tài)，描繪細(xì)菌形態(tài)(簡(jiǎn)單染色）

（7）顯微鏡使用完畢后的處理

①觀察結(jié)束后清洗鏡頭

*取下載玻片

?*撕開(kāi)擦鏡紙

*擦去鏡頭上的香柏油

?。?！注意：將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2-3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭

*沾取二甲苯

*擦掉殘留的香柏油

?*再擦去殘留的二甲苯

②收顯微鏡和載玻片

*關(guān)閉電源

*拔下插頭

*套上鏡套

*擦拭載玻片

?*封存載玻片

五、注意事項(xiàng)

(1) 油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般光學(xué)顯微鏡的油浸物鏡沒(méi)有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。

(2) 染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

（3）革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。

（4）選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。