一、電轉(zhuǎn)的簡介：

電穿孔轉(zhuǎn)染，作為物理方法的一種，不僅能將DNA、RNA，還能將抗體、酶及其他生物活性分子轉(zhuǎn)入細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞。它是一種高效、簡便的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，具有其他轉(zhuǎn)移方法無法比擬的優(yōu)越性：

如操作簡便、快捷，可重復(fù)性強(qiáng)，轉(zhuǎn)染率高，適用廣譜等，在面對公認(rèn)難轉(zhuǎn)的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，此方法也能獲得較高的轉(zhuǎn)染率轉(zhuǎn)染。

二、電轉(zhuǎn)染原理：

電穿孔法：就是通過電場作用于細(xì)胞幾微妙到幾毫秒之后，在細(xì)胞膜上暫時形成小孔或開口，把大分子例如DNA等導(dǎo)入細(xì)胞并最終進(jìn)入到細(xì)胞核中的技術(shù)。

簡單來說：第一步在電擊的過程中，細(xì)胞膜上出現(xiàn)穿孔，質(zhì)粒在電泳力的作用下與細(xì)胞膜接觸，并且在細(xì)胞膜上電穿孔的區(qū)域形成一種可轉(zhuǎn)移的復(fù)合物。再次電擊后，質(zhì)粒脫離復(fù)合物并擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部，開始瞬時轉(zhuǎn)染，同時小部分質(zhì)粒進(jìn)入核內(nèi)與染色體整合，開始穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。一旦DNA擴(kuò)散至細(xì)胞，膜上小孔會關(guān)閉

三、電穿孔轉(zhuǎn)染條件的選擇

1、電場參數(shù)

電場是電轉(zhuǎn)染的重要因素，細(xì)胞在電場的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成轉(zhuǎn)染過程。

因此電場強(qiáng)度是應(yīng)該被優(yōu)化的主要參數(shù)。此外，電場的強(qiáng)度不能太高，不然會增加細(xì)胞的死亡率，相對的液不能太低，這樣就不能增加膜的通透性難在膜上形成小孔，因此，一個適宜的電場強(qiáng)度尤其重要。

不同細(xì)胞系有著不同的最佳場強(qiáng)值，其確定方法除了實驗直接測定比較不同場強(qiáng)下轉(zhuǎn)染率的高低外，還可以采取較為簡便的間接法。

(附：存活率在50%左右的電場參數(shù)為理想?yún)?shù)，所以可以間接測定存活率來確定最佳電場強(qiáng)值。）

2、脈沖過程

①脈沖波形

脈沖波形主要分為兩種：一種為方波脈沖；另一種為指數(shù)遞減波脈沖。

方波脈沖是指：電壓瞬間升至預(yù)設(shè)電壓，保持電壓放電，然后瞬間終止放電。

一般哺乳動物細(xì)胞電轉(zhuǎn)染時選擇方波脈沖，有較高的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。

指數(shù)遞減波脈沖是指：先對電容充電，然后讓電容完全放電，其電壓變化呈指數(shù)遞減。一般這種波形的脈沖電轉(zhuǎn)染適用于細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞。

②脈沖時間

脈沖時間的選定主要取決與脈沖波形。在方波脈沖中，脈沖時間可直接設(shè)定。在指數(shù)遞減波脈沖中，脈沖時間是指電壓衰減至初始電壓1/3時所用的時間，等于電容（C）與電阻（R）的乘積，單位是ms。在參數(shù)優(yōu)化中，增加電壓應(yīng)當(dāng)降低脈沖時間，而減小電壓則應(yīng)當(dāng)增大脈沖時間。

③脈沖次數(shù)

一般而言，對于大多數(shù)細(xì)胞類型都選擇單詞脈沖。而在有些情況下可能會用到多次脈沖，因為低電壓、短脈沖時間、多次脈沖可有效避免細(xì)胞損傷。多次脈沖建議中間間隔1min。

3、細(xì)胞因素

用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因為處于對數(shù)生長期的細(xì)胞分裂旺盛，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA.細(xì)胞懸液濃度一般為1﹡106/ml，當(dāng)細(xì)胞生長密度大于3﹡106/ml，轉(zhuǎn)染效率會下降。原因除了細(xì)胞老化外，細(xì)胞過密會使相鄰細(xì)胞相互作用增大，甚至使細(xì)胞相互融合，從而導(dǎo)致電場的局部微擾，使電場環(huán)境無法均一化，細(xì)胞體積越大對電擊越敏感，所需電場強(qiáng)度也越小。

4、質(zhì)粒因素

從質(zhì)粒濃度看，細(xì)胞密度為1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml轉(zhuǎn)染效率最高。轉(zhuǎn)染率在一定范圍內(nèi)隨質(zhì)粒濃度的上升呈線性增高，但是到達(dá)一個峰值后，隨DNA用量增加而轉(zhuǎn)染率逐漸下降，其原因可能為細(xì)胞吸納DNA有一個飽和度，過量便會產(chǎn)生毒性，使存活率降低，不利于轉(zhuǎn)染率提高。

進(jìn)行小分子量的分子轉(zhuǎn)染時（siRNA/miRNA），應(yīng)使用高電壓、短脈沖時間。大分子量分子轉(zhuǎn)染時（DNA），應(yīng)使用低電壓，長脈沖時間。

從質(zhì)粒的純度看，用高純度的DNA才 能提高電轉(zhuǎn)的效率，且應(yīng)注意以下幾點：

首先DNA／RNA應(yīng)該超純(A260／A280>1．8)，其次應(yīng)不含內(nèi)毒素，同時質(zhì)粒應(yīng)溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液。

5、溫度

一般情況下，電轉(zhuǎn)的過程是在室溫下進(jìn)行，但在電擊前后可對細(xì)胞進(jìn)行冰浴處理。電擊前冰浴的時間對轉(zhuǎn)染率影響不大，但低溫環(huán)境能夠防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在電擊中因Joule作用而產(chǎn)生的不良反應(yīng)，因此，實驗一般選擇電擊前冰浴5min。電擊后冰浴，會影響DNA攝入，因為電擊后冰浴可增強(qiáng)細(xì)胞收縮，細(xì)胞膜上的 電穿孔封閉較慢，延長外源性DNA攝入時間，從而提高其攝入量。在室溫環(huán)境下，雖然細(xì)胞膜上的孔 封閉速度快，但在隨后2h，質(zhì)粒還可通過電內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，因此攝人量不一定比4℃環(huán)境下低。而且，室溫下細(xì)胞在5 min內(nèi)即閉孔，在4℃的環(huán)境下穿孔狀態(tài)可保持4h，穿孔封閉緩慢降低了存活率，同時細(xì)胞在低溫下更容易受到損傷。

因此，綜合考慮攝人量和存活率，大部分文獻(xiàn)傾向于電擊后細(xì)胞仍在室溫或37℃下保存。

6、電轉(zhuǎn)染試劑的選擇

電擊會對細(xì)胞造成一定程度的傷害，在轉(zhuǎn)染試劑的選擇上要注意，應(yīng)選擇具有細(xì)胞膜修復(fù)成分的電轉(zhuǎn)染試劑

7、電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)液的選擇

細(xì)胞在電擊后十分脆弱，所以在培養(yǎng)液的選擇中應(yīng)該最注重提高細(xì)胞的存活率，一般選擇低滲的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可參考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因為海藻糖具有穩(wěn)定DNA、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜的作用，并提高電轉(zhuǎn)后細(xì)胞特別是淋巴細(xì)胞的存活率。

（附：調(diào)亡是細(xì)胞電擊后死亡的主要原因，電擊后的培養(yǎng)液還可以加入Caspase抑制劑和SCFGM-CSF等細(xì)胞因子）