盡管節(jié)點不一，全球各地正眼看著走出新冠的陰霾。這場新冠疫情的罪魁禍首，就是SARS-CoV-2 病毒。這種病毒在電子顯微鏡下可以觀察到一圈皇冠樣的凸起，因而被稱為冠狀病毒，區(qū)別于以往出現(xiàn)的SARS冠狀病毒（2002年）和MERS冠狀病毒（2012年），進而被命名為新冠病毒。

新冠病毒的鑒定方法主要有全基因組測序、Real Time RT-PCR以及電子顯微鏡技術等。其中電鏡技術具有“所見即所得”的優(yōu)勢，可以直接觀察新冠病毒形貌，從而確定其種屬，具有直觀便捷等優(yōu)點。此外，高分辨冷凍電鏡還能解析病毒的近原子分辨率結(jié)構(gòu)，尤其是關鍵功能結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)，為基于結(jié)構(gòu)的藥物設計提供重要依據(jù)，是揭開新冠病毒神秘面紗極其重要的科學利器。 下面，我們就來匯總一下可以用于新冠病毒研究的各種電鏡技術。 01

常溫電鏡

常溫透射電鏡TEM

最常見的是負染電鏡技術，即用重金屬鹽直接對分離出來的病毒進行染色，在120 kV常溫透射電鏡下來直接觀察新型冠狀病毒的形態(tài)、大小等特征，這種技術具有快速便捷的優(yōu)勢（見圖1）。 如果需要進一步探究病毒侵染宿主及其擴增過程，這就需要采用組織切片電鏡技術，即用分離出的病毒感染體外培養(yǎng)細胞，經(jīng)過常規(guī)透射電鏡制樣（固定/脫水/滲透/包埋/切片/染色），進而在常溫透射電鏡下來觀察新型冠狀病毒在細胞內(nèi)的形態(tài)、大小、分布及侵染釋放過程（見圖2）。

圖1 常溫透射電鏡下SARS-CoV-2 病毒照片（中國疾控中心）

圖2 常溫透射電鏡下SARS-CoV-2 病毒照片（武漢病毒所）

常溫掃描電鏡SEM

如果需要更直觀地觀察到病毒的立體形貌及細胞的侵染過程，常規(guī)掃描電鏡技術也可以實現(xiàn)這一需求：分離出的病毒感染體外培養(yǎng)細胞，經(jīng)過常規(guī)掃描電鏡制樣技術（固定/脫水/臨界點干燥/鍍膜），在常溫掃描電鏡下來觀察病毒（見圖3-1）。當然，也可以給病毒圖片涂上醒目的顏色便于觀察（見圖3-2）。

圖3-1 常溫掃描電鏡下SARS 病毒照片（新加坡國立大學）

圖3-2 常溫掃描電鏡下SARS-CoV-2 病毒照片（美國國立過敏與傳染病研究所）

大體積掃描電鏡和雙束電鏡

在三維大體積中揭示病毒對宿主的感染情況，如感染量及亞細胞器定位分布，對揭示病毒的感染機制及宿主的發(fā)病機制至關重要。

目前有兩種高度自動化的大體積三維成像電鏡技術：連續(xù)切面電鏡成像技術（Serial Block Face Imaging, SBFI）和聚焦離子束掃描電鏡技術（Focused Ion Beam SEM)

?？刹捎贸Ｒ?guī)樹脂包埋塊或高壓冷凍后樹脂包埋等方法對病毒感染的細胞或組織進行樣品制備，然后進行自動化三維電鏡成像。SBFI技術使用儀器內(nèi)置鉆石刀自動完成邊切片邊掃描成像，能夠處理的樣品體積比較大，可以達到1mm，結(jié)合Multi-energy deconvolution技術可實現(xiàn)Z軸分辨率10nm的各向同性分辨率成像（見圖4）。FIB-SEM聚焦離子束掃描電鏡因采用離子源對樣品進行切割，更穩(wěn)定，可實現(xiàn)更高的Z軸分辨率，相對來說可處理的樣品體積會小一些（見圖5）。

圖4 大體積掃描電鏡下Cowpox病毒

圖5 常溫雙束電鏡下Human Cytomegalovirus病毒（烏爾姆大學）

02

冷凍透射電鏡cryoEM

冷凍透射電鏡看全貌

如何才能觀察到真實天然的新型冠狀病毒呢？冷凍電鏡技術給出了答案：直接將分離純化的病毒顆粒快速投入到液氮冷卻的液態(tài)乙烷中冷凍，形成無定形冰層，保留滅活病毒的天然狀態(tài)，再放到200 kV或者300 kV冷凍電鏡下觀察到的就是完整滅活新冠病毒的真實面貌（見圖6）。

圖6 冷凍電鏡下SARS-CoV-2 滅活病毒（南方科技大學）

單顆粒分析技術獲取高分辨結(jié)構(gòu)

新冠病毒藥物設計和疫苗研發(fā)可以采取基于結(jié)構(gòu)的藥物設計策略，冷凍電鏡單顆粒分析技術可以大大加速這個過程，通過深入的高分辨結(jié)構(gòu)研究，尤其是功能結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)、相關的受體蛋白結(jié)構(gòu)以及二者結(jié)合態(tài)結(jié)構(gòu)，可以進一步揭示病毒侵染宿主細胞的詳細過程。根據(jù)已有病毒基因序列（刺突糖蛋白)，進行病毒基因擴增、載體構(gòu)建、重組病毒蛋白表達、純化、濃縮、冷凍制樣，然后放到200 kV或者300 kV冷凍電鏡中收集數(shù)據(jù)，通過三維重構(gòu)得到其近原子分辨率（3.5埃）的高清結(jié)構(gòu)（如圖7）。 除此之外，科學家利用冷凍電鏡解析了新冠病毒受體ACE2全長蛋白結(jié)構(gòu)，以及新冠病毒刺突糖蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與ACE2全長蛋白的復合物結(jié)構(gòu)（2.9埃和3.5埃，西湖大學），又成功解析了新冠病毒RdRp（RNA依賴的RNA聚合酶）-nsp7-nsp8復合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)（2.9埃，上?？萍即髮W-清華大學）。

圖7 冷凍電鏡下SARS-CoV-2 病毒的刺突糖蛋白（德克薩斯大學奧斯汀分校）

冷凍電子斷層掃描看細胞原位結(jié)構(gòu)

如果要進一步研究病毒侵染細胞的詳細過程，進行細胞原位分析研究，可以采用另外一種冷凍電鏡技術 –

冷凍電子斷層掃描技術（Cryo-ET）

，其工作流程是將細胞進行冷凍制樣（沖入式或者高壓冷凍）在熒光顯微鏡下鎖定標記好蛋白的位置，再通過光電聯(lián)用 (CLEM) 技術轉(zhuǎn)化為電鏡可識別的坐標，進而使用冷凍雙束電鏡進行冷凍減薄或者冷凍減薄提取制備冷凍薄片，然后放到300 kV冷凍電鏡上進行冷凍電子斷層掃描成像（如圖8）。Cryo-ET提供了結(jié)構(gòu)構(gòu)象的信息，有助于理解擾亂病毒功能的新機制，從而為抗病毒藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

圖8 冷凍電子斷層掃描技術獲取的Pseudorabies病毒圖片（中國科技大學）