基因的具體功能一直是科學(xué)研究的熱門(mén)方向，但以人的基因組為例，大約有2萬(wàn)個(gè)基因，如果挨個(gè)系統(tǒng)性研究，那工作量太大而基本無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此，高通量基因篩選方式應(yīng)運(yùn)而生。從一開(kāi)始的RNAi，CRISPR，到目前流行的自定義寡核苷酸池，逐步實(shí)現(xiàn)了更多文庫(kù)類(lèi)型、更多篩選模式、更多應(yīng)用方向的篩選需求。 在功能基因高通量篩選過(guò)程中，為了獲得更加可靠的結(jié)果，往往會(huì)將混合篩選得到結(jié)果進(jìn)行陣列篩選驗(yàn)證。這篇文章巧妙的利用寡核苷酸池構(gòu)建CRISPR混合慢病毒文庫(kù)，將混合篩選得到候選基因進(jìn)行siRNA陣列驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了寡核苷酸、CRISPR及RNAi的夢(mèng)幻聯(lián)動(dòng)。

Background

： 在已知的SARS-CoV-2蛋白相互作用組的基礎(chǔ)上，利用OLS寡核苷酸池構(gòu)建CRISPR文庫(kù)，篩選與SARS-CoV-2病毒及3三種季節(jié)性冠狀病毒感染相互作用的宿主蛋白，為抗擊COVID-19提供潛在靶點(diǎn) ?

Workflow

:

1.?寡核苷酸池設(shè)計(jì)

：選取332個(gè)宿主蛋白基因，每個(gè)基因設(shè)計(jì)10條sgRNA，加上對(duì)照，總計(jì)3944條sgRNA

2.?寡核苷酸池應(yīng)用

：合成寡核苷酸池，溶解稀釋后，PCR擴(kuò)增添加克隆位點(diǎn)，純化回收PCR產(chǎn)物

3.?重組質(zhì)粒載體構(gòu)建

：生成lentiGuidePurov2 sgRNA混合質(zhì)粒文庫(kù)，將混合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至Endura感受態(tài)細(xì)胞，刮取菌落，提取質(zhì)粒

4.?NGS評(píng)估sgRNA分布

：擴(kuò)增sgRNA靶向區(qū)域，在擴(kuò)增子中添加illumina測(cè)序接頭、隨機(jī)核酸切口及分子條形碼，切膠回收擴(kuò)增子，Ilumina NextSeq平臺(tái)測(cè)序

5.?混合慢病毒文庫(kù)構(gòu)建

：將重組lentiGuidePurov2 質(zhì)粒, 輔助質(zhì)粒VSV-G和HIV Gag-Pol共轉(zhuǎn) Lenti-X 293T

TM

細(xì)胞，收集、純化、濃縮病毒，等分后-80℃保存

6.?CRISPR-Cas9基因篩選

：混合慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Huh-7.5-Cas9細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)第2天加入稀釋好的冠狀病毒，感染2周后收集存活的細(xì)胞，分離純化gDNA，PCR擴(kuò)增gDNA，SPRI beads純化與片段篩選，Illumina NexSeq 500平臺(tái)測(cè)序。

7.?siRNA陣列文庫(kù)驗(yàn)證候選基因

：將Huh-7.5細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞板中，轉(zhuǎn)染siRNA 60h后加入冠狀病毒，孵育24h后，進(jìn)行免疫熒光測(cè)定 ?

Screening result

：?

核心CRISPR sgRNA慢病毒文庫(kù)篩選結(jié)果顯示，SCAP, HS2ST1, EIF42以及Rab家族中部分基因sgRNA富集，表明這些SARS-CoV-2蛋白互作子在病毒感染、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中起著重要的作用。且富集的sgRNA大多隸屬于safe-targeting sgRNA，在沒(méi)有病毒感染的情況下敲除這些基因不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性造成影響，因此，可作為SARS-CoV-2治療的候選靶點(diǎn)。 ?

同時(shí)，通過(guò)定制siRNA陣列文庫(kù)進(jìn)行CRISPR篩選結(jié)果驗(yàn)證，敲低相關(guān)宿主因子表達(dá)會(huì)明顯減弱病毒感染，進(jìn)一步證明了CRISPR篩選結(jié)果的穩(wěn)健性。 ?

Discussion

： 此研究借助自定義寡核苷酸池，設(shè)計(jì)生成核心sgRNA文庫(kù)，進(jìn)行CRISPR混合病毒深度篩選，與全基因組CRISPR廣泛篩選相比，其優(yōu)點(diǎn)為：1）增加序列覆蓋度——每個(gè)基因設(shè)計(jì)10個(gè)sgRNA；2）應(yīng)用多重篩選條件——不同類(lèi)型的冠狀病毒、溫度等；3）提高信噪比——排除主導(dǎo)篩選結(jié)果的sgRNA靶向基因。最終，通過(guò)多種功能性讀值驗(yàn)證全基因組CRISPR篩選中遺漏的的關(guān)鍵宿主因子。綜上，此研究提出了一種通用的篩選方法來(lái)探索宿主與病原體之間蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及功能基因組學(xué)，為抗病毒策略提供候選靶點(diǎn)。 ?

文獻(xiàn)好物推薦

：

G-custom鏈接：

https://horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/cherry-pick-library-loader

? T-2004-02鏈接：

https://horizondiscovery.com/en/transfection-and-ancillary-reagents/products/dharmafect-4-transfection-reagent?catalognumber=T-2004-02

? Reference:

Hoffmann HH, Sánchez-Rivera FJ, Schneider WM, et al. Functional interrogation of a SARS-CoV-2 host protein interactome identifies unique and shared coronavirus host factors.?Cell Host Microbe. 2021;29(2):267-280.e5. doi:10.1016/j.chom.2020.12.009

更多精彩，請(qǐng)關(guān)注“優(yōu)寧維分子生物學(xué)”公眾號(hào)，進(jìn)行咨詢(xún)