前言

心血管疾病 (CVD) 仍然是西方國家死亡和發(fā)病的主要原因，因此需要有助于 CVD 發(fā)展和進(jìn)展的新治療靶點(diǎn)。非靶向代謝組學(xué)正在成為發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的途徑的強(qiáng)大平臺，作者對 T2DM 受試者的血漿進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析，并結(jié)合機(jī)理研究，揭示了通過代謝途徑形成的代謝物在 T2DM 受試者中增強(qiáng)，并與 T2DM 和非糖尿病受試者的 CVD 風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)。

必需氨基酸苯丙氨酸(Phe) 是腸道微生物群產(chǎn)生的代謝物苯乙酰谷氨酰胺 (PAGln)的營養(yǎng)前體，PAGln 在臨床和機(jī)制上都與 CVD 相關(guān)，并顯示通過宿主 G 蛋白偶聯(lián)受體促進(jìn) CVD 相關(guān)表型，包括 α2A、α2B 和 β2-腎上腺素能受體 (ADR)。

本篇由美國克利夫蘭診所勒納研究所心血管與代謝科學(xué)部Stanley L. Hazen教授課題組在Cell期刊（IF:66.850）發(fā)表了題為的研究成果，通過非靶向代謝組學(xué)、靶向代謝組學(xué)與腸道微生物菌群聯(lián)合研究方法，發(fā)現(xiàn)了心血管疾病發(fā)生的特征，為心血管疾病防治提供了理論依據(jù)。

技術(shù)流程

研究方法

• 研究材料/樣本：

  無菌小鼠，兩個臨床隊(duì)列（5162名受試者）

• 主要組學(xué)研究方法：

? ?LC-MS 非靶標(biāo)代謝組分析、靶向代謝組學(xué)、腸道微生物研究

研究結(jié)果

1. 非靶向代謝組學(xué)：鑒定 PAGln 與 CVD 相關(guān)

對1162名受試者血漿進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測，三個篩選策略如下：(1)與事件（3年）主要不良心臟事件（MACE =心肌梗死（MI）、中風(fēng)或死亡）相關(guān)；(2)T2DM水平升高；(3)與血糖控制指標(biāo)的相關(guān)性差。研究發(fā)現(xiàn)一種與MACE最相關(guān)未知物（m/z 265.1188）滿足篩選標(biāo)準(zhǔn)（圖1A, B），經(jīng)鑒定該物質(zhì)為PAGln（圖1C）。建立該物質(zhì)同位素液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)絕對定量方法，對另一獨(dú)立隊(duì)列（n=4,000，驗(yàn)證集）進(jìn)行PAGln靶向驗(yàn)證，該隊(duì)列中T2DM受試者和MACE受試者血漿PAGln水平都相對較高。Kaplan-Meier生存分析顯示，高PAGln水平與MACE高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（圖1D），較高的PAGln水平仍是MACE風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測因子（圖1E）。

圖1 | 非靶向代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)m/z為 265.1188 的代謝物與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，隨后被鑒定為苯乙酰谷氨酰胺

2. 功能驗(yàn)證：腸道微生物群參與體內(nèi)PAGln 和苯乙酰甘氨酸的產(chǎn)生

通過檢測基線（Pre-Abx）、7天廣譜復(fù)合抗生素處理（Abx）和3周清除期菌群重塑（Post-Abx）的血漿PAGln水平（n=15），發(fā)現(xiàn)PAGln水平受腸道微生物影響（圖2A）。有研究表明，PAGln由苯乙酸（PAA）與谷氨酰胺（Gln）在肝酶的作用下形成，而PAA由苯丙氨酸（Phe）經(jīng)菌群代謝產(chǎn)生。此外，PAA也可與甘氨酸（Gly）結(jié)合形成苯乙酰甘氨酸（PAGly）。

研究人員評估了健康受試者（n=25）和小鼠體內(nèi)PAGly及PAGln水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人體中以PAGln為主，而小鼠中以PAGly為主（圖2B），小鼠腹腔注射PAA后，主要生成PAGly（圖2C）。比較常規(guī)飼養(yǎng)和GF小鼠或Abx干預(yù)前后的血清PAGly水平，表明腸道菌群是生成PAGly的重要參與者（圖2B, 2D）。因此，在人類和小鼠中，PAGln和PAGly都是通過一種代謝途徑產(chǎn)生，飲食中的Phe通過腸道菌群轉(zhuǎn)化為PAA，宿主與Gln（人類）或Gly（嚙齒動物）發(fā)生共軛反應(yīng)，分別產(chǎn)生PAGln和PAGly（圖2E）。

圖2 | PAGln體內(nèi)生產(chǎn)是人類和小鼠中微生物群依賴性的過程

3. 表型驗(yàn)證1：PAGln 增強(qiáng)血小板刺激誘導(dǎo)的鈣釋放和對多種激動劑的反應(yīng)

根據(jù)人PAGln水平與血栓事件正相關(guān)性，提示PAGln可影響血小板功能和血管基質(zhì)相互作用。研究結(jié)果顯示，PAGln加速了膠原依賴性血小板粘附和擴(kuò)散速度（圖3A-3C），并呈現(xiàn)劑量依賴性（圖3D, 3E），表明PAGln可能與血小板直接相互作用，促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)Ca濃度（[Ca]i）呈現(xiàn)依賴性升高，并進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證（圖3G）。此外，在PAGly實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似結(jié)果。因此，腸道菌群相關(guān)代謝產(chǎn)物PAGln和PAGly顯著影響血小板功能，增強(qiáng)血小板與膠原基質(zhì)的粘附，以及血小板刺激依賴性[Ca]i升高和對激動劑的聚集反應(yīng)。

圖3 | PAGln 增強(qiáng)血小板反應(yīng)性

4. 表型驗(yàn)證2 :PAGln 加速血小板凝塊形成并增強(qiáng)體內(nèi)血栓形成潛力

通過FeCl誘導(dǎo)的頸動脈損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，PAGln和PAGly都能加劇損傷的頸動脈內(nèi)血栓形成（圖4A），且與對照組相比，相應(yīng)地減少了損傷后血流停止的時間（圖4B）。

圖4 | PAGln 和 PAGly 增強(qiáng)體內(nèi)血栓形成的可能性

5. 機(jī)制探究1：腸道微生物基因porA和fldH在體內(nèi)調(diào)節(jié)宿主血栓形成潛力

有研究報(bào)道Phe主要由生孢梭菌（Clostridium sporogenes）代謝為PAA（氧化途徑）和苯丙酸（PPA）（還原途徑），隨后分別與Gln或Gly縮合形成PAGln或PAGly。其中參與反應(yīng)的酶主要由porA或fldH基因編碼。于是作者構(gòu)建了porA或fldH基因缺失的C. sporogenes突變株。結(jié)果顯示，含有功能性基因porA和fldH的(ΔcutC) C. sporogenes僅產(chǎn)生同位素標(biāo)記的PPA，而不產(chǎn)生PAA；（ΔcutC,ΔfldH）C. sporogenes(具有porA功能)不再產(chǎn)生PPA；（ΔcutC,ΔporA）C. sporogenes（具有fldH功能）不再產(chǎn)生PAA（圖4C）。然后通過突變株定植GF小鼠以及頸動脈損傷實(shí)驗(yàn)表明，基因porA主要影響PAA產(chǎn)生，而fldH主要調(diào)節(jié)PPA產(chǎn)生，且敲除fldH會增加PAA水平繼而影響PAGly水平從而顯著降低血栓形成。

6. 機(jī)制探究2：PAGln 通過 G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)細(xì)胞事件

研究發(fā)現(xiàn)，GPCR信號通路調(diào)節(jié)劑和抑制劑均顯著降低了PAGln誘導(dǎo)的DMR反應(yīng)（圖5A，5B）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PAGln可影響cAMP水平，并證實(shí)PAGln在多個細(xì)胞中包括分離出的人血小板中通過GPCR(s)介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)。研究人員發(fā)現(xiàn)PAGln與兒茶酚胺結(jié)構(gòu)相似（圖5E），暗示PAGln通過腎上腺素能受體（ADRs）發(fā)揮作用。遺傳和藥理學(xué)方法的功能喪失和功能獲得研究證實(shí)，PAGln可通過G蛋白偶聯(lián)受體（包括α2A，α2B和β2-ADRs）介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)（圖5和圖6A, B）。

圖5 | PAGln 通過 G 蛋白偶聯(lián)受體和 ADR 介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)

7. 功能驗(yàn)證：腸道微生物群依賴性代謝物 PAGln 通過 ADR 發(fā)揮作用

通過功能增益研究證實(shí) PAGln 可以通過 α2A、α2B 和 β2 ADR 發(fā)出信號，為了進(jìn)一步證實(shí) PAGln 通過 ADR 發(fā)揮作用的能力，研究者在人胚胎腎細(xì)胞(HEK293) 中單獨(dú)過表達(dá) α2A、α2B 和 β2 ADR 進(jìn)行了功能獲得性研究。在多種細(xì)胞類型中采用遺傳或藥理學(xué)方法的功能喪失和功能獲得研究均證實(shí) PAGln 可通過 α2A、α2B 和 β2 ADR 誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)。

圖6 | PAGln 通過 ADR 調(diào)節(jié)血小板功能和體內(nèi)血栓形成潛力

研究討論

目前的研究證實(shí)了腸道微生物群在人和小鼠的 PAGln（和 PAGly）生成中的主要作用，PAGln 升高與 CVD 風(fēng)險(xiǎn)之間的臨床關(guān)聯(lián)可能通過幾種機(jī)制發(fā)生。首先，PAGln 可能通過多種互補(bǔ)方法影響血栓形成，其次，PAGln 可能與GPCRs （包括 ADRs）的相互作用影響 CVD 的相關(guān)表型。盡管目前的研究僅關(guān)注人類血小板中表達(dá)的三種 ADR，但可以推測 PAGln 具有調(diào)節(jié)其他 ADR 的潛力，因此可能會影響多種與 ADR 相關(guān)的體內(nèi)生理過程。

研究證實(shí)，腸道微生物群衍生代謝物 PAGln 可增強(qiáng)全血、分離的血小板和動脈損傷動物模型中的血小板活化相關(guān)表型和血栓形成潛力。對人類共生體的功能和基因工程研究，再加上無菌小鼠的微生物定植，表明微生物基因有助于將膳食苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為 m/zporA苯乙酸，隨后宿主產(chǎn)生 PAGln 和苯乙酰甘氨酸 (PAGly)，促進(jìn)血小板反應(yīng)性和血栓形成潛力。使用遺傳和藥理學(xué)工具的功能增益和功能喪失研究均揭示 PAGln 通過 G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)細(xì)胞事件，包括 α2A、α2B 和 β2-腎上腺素能受體。因此，PAGln 代表了一種新的促進(jìn) CVD 的腸道微生物群依賴性代謝物，它通過腎上腺素能受體發(fā)出信號。

小鹿推薦

這項(xiàng)研究通過兩個臨床隊(duì)列的非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)以及微生物菌群的研究發(fā)現(xiàn)了一種新的心血管疾病相關(guān)的腸道菌群代謝衍生物——苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)揭示了該物質(zhì)的菌群和宿主代謝途徑，以及促進(jìn)血栓形成的分子機(jī)制，證實(shí)了腸道菌群-代謝物在心血管等臨床疾病中發(fā)揮著不容忽視的重要作用。為心血管疾病研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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