發(fā)表期刊：Cell Metabolism

影響因子：22.415

發(fā)表時間：2019年5月30日

合作單位：中國科學技術大學

Biotree協(xié)助客戶中國科學技術大學吳緬教授和安徽醫(yī)科大學胡汪來教授及其研究團隊在國際頂尖期刊《Cell Metabolism》上發(fā)表名為“CircACC1 Regulates Assembly and Activation of AMPK Complex under Metabolic Stress?”的研究成果。CircRNA+代謝組，如何研究才能發(fā)表在IF=22.415的頂級期刊上？下面小趣和大家一起學習下這篇文章的精彩之處。

研究背景

AMPK（AMP活化蛋白激酶）是維持能量平衡的重要代謝酶之一，是細胞能量狀態(tài)關鍵感受器，平衡細胞的合成和分解，在控制脂肪酸氧化、糖酵解和脂解作用中起重要作用。百趣代謝組學文獻分享，AMPK已在2型糖尿病和代謝綜合征中得到廣泛研究，被視為癌癥治療重要的潛在靶點。目前對于非編碼RNA調控AMPK的研究有限，已有報道LncRNA參與調控AMPK，但CircRNA是否參與AMPK調控卻尚未研究。

研究結果

1. CircACC1的發(fā)現(xiàn)和鑒定

作者試圖找到與脂質代謝相關的circRNA，首先找出與脂質代謝有關的91個基因，結合前人研究過的1444個circRNAs，篩選出了6個候選基因，7個circRNAs。然后作者在HCT細胞中用RNA酶消化后，RT-PCR檢測7種circRNAs的表達水平，7種circRNAs都有表達。百趣代謝組學文獻分享，用siRNA抑制每個circRNA的表達，發(fā)現(xiàn)只有抑制circACC1時會導致脂質積累，證明了circACC1與脂質代謝相關。

circACC1是來源于人類17號染色體的ACC1基因，與小鼠序列沒有同源性，后面Northern雜交的試驗也驗證了是環(huán)狀的RNA。用RNase R處理對Total RNA進行qPCR分析，結果表明circACC1和CDR1未被降解，而β-actin和ACC1 mRNA被降解。百趣代謝組學文獻分享，Actinomycin D處理結果也表明circACC1比ACC1 mRNA更穩(wěn)定。這些都證明circACC1確實是環(huán)狀的RNA。

圖1. CircACC1的鑒定及參與脂質代謝

2.CircACC1促進糖酵解和脂肪酸氧化

為了進一步研究circACC1的功能，作者在LO2（人正常肝細胞系）細胞中敲低circACC1發(fā)現(xiàn)脂質含量升高。相反，在HCT116和LO2中過表達circACC1則脂質含量降低。circACC1的敲除或超表達對ACC1 mRNA和ACC1蛋白水平沒有影響。百趣代謝組學文獻分享，對circACC1沉默后細胞中的脂質成分進行代謝組分析，包括用LC-MS分析脂質代謝及GC-MS檢測游離脂肪酸，結果發(fā)現(xiàn)脂質及游離脂肪酸含量顯著增高。

AMPK是維持能量平衡的重要樞紐，在能量應激中，AMPK通過磷酸化PFK-2從而促進糖酵解， 通過磷酸化ACC1抑制脂肪酸合成。敲低circACC1抑制了ACC1和PFKFB3的磷酸化，過表達circACC1促進PFKFB3的磷酸化。沉默circACC1后細胞中ATP、NADPH和胞外乳酸含量均增加，同時增加了ROS水平，而超表達circACC1后結果完全相反。這些數(shù)據表明circACC1可以增強AMPK的活性，從而促進糖酵解和脂肪酸的氧化。

圖2.?CircACC1促進糖酵解和脂肪酸氧化

3.CircACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結合

上述結果表明circACC1可以調控AMPK，那么它們是如何相互作用的呢？作者進行了進一步研究。FISH試驗表明AMPK和circACC1都存在于細胞質中。Pull-down試驗表明AMPK的每一個亞單位都可以用反義探針選擇性地捕獲。百趣代謝組學文獻分享，RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，circACC1與AMPK β1和γ1亞單位有很強的相互作用，但與ɑ1的結合很小。

在此基礎上，作者進一步研究circACC1與AMPK β1和γ1的相互作用是否與全酶有關。百趣代謝組學文獻分享，兩步免疫共沉淀均可檢測到circACC1和AMPK3個亞基。體外EMSA實驗表明只有AMPK β1和γ1能與circACC1進行共沉淀，而ɑ1不能。將P1段拆分為P1和P2兩段，最終研究發(fā)現(xiàn)P1段是circACC1與AMPK β 和 γ 結合位點。

圖3. CircACC1與AMPK的 β 和 γ 亞基直接結合

4.CircACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性

上面的試驗發(fā)現(xiàn)敲低circACC1導致AMPK三個亞基水平均降低，蛋白酶體抑制劑能恢復因敲低circACC1導致的AMPK水平下調，表明circACC1影響AMPK蛋白質穩(wěn)定性。百趣代謝組學文獻分享，circACC1敲低顯著降低了AMPK的半衰期，增加AMPK亞基多聚泛素化水平。單獨敲除AMPK的三個亞基會導致其他亞基水平大大降低。用MG132穩(wěn)定蛋白水平后，敲除circACC1后AMPK亞基間結合能力下降，表明circACC1可以提高AMPK全酶的穩(wěn)定性。作者同時用哺乳動物雙雜交試驗進行進一步驗證，結果表明circACC1沉默使AMPK β1和γ1結合作用降低，超表達circACC1使AMPK β1和γ1結合能力增強。

圖4. CircACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性

5. CircACC1直接調控AMPK的活性

AMPK在維持能量平衡中起著非常重要的調控作用，可以感知和響應細胞能量和營養(yǎng)狀態(tài)的變化。那么不同的應激條件是如何影響circACC1的表達呢？RT-PCR結果分析表明，血清饑餓狀態(tài)能刺激circACC1的表達以及pre-ACC1的生成，但是對成熟circACC1 mRNA的表達水平并無影響。隨后補充血清發(fā)現(xiàn)circACC1的水平也隨之降低，說明circACC1 受到血清水平有效的調節(jié)。

百趣代謝組學文獻分享，AMPK的活性受幾種激酶的調控，包括LKB1，CaMKK2和TAK1。那么circACC1是否是通過這些激酶調節(jié)AMPK的活性呢？作者對此也進行了研究，敲除LKB1、CaMKK2和TAK1確實能夠降低AMPK和PFKFB3的活性，并降低了ACC1磷酸化。然后分別干涉LKB1、CaMKK2和TAK1，超表達circACC1，發(fā)現(xiàn)AMPK活性增強，而不受三種激酶表達的影響。說明circACC1可以直接調節(jié)AMPK的活性，而不是通過激酶調節(jié)。

圖5. CircACC1調控AMPK的活性

6.在血清饑餓狀態(tài)下C-Jun促進CircACC1的表達

對ACC1的啟動子進行分析，有CEBPA、c-Jun、CREB1和SREBF1結合位點，為了確定這些轉錄因子是否參與circACC1的調控，作者分別對這些轉錄因子進行敲除研究，發(fā)現(xiàn)只有c-Jun的沉默會顯著降低circACC1的表達，表明c-Jun參與了circACC1的調控。百趣代謝組學文獻分享，隨后作者用CHIP試驗和熒光素酶報告驗證了c-Jun與ACC1啟動子的結合。血清饑餓后誘導c-Jun激活，JNK和 AMPK信號增強，ACC1的水平降低。干涉c-Jun后AMPK和PFK2活性降低，超表達 circACC1后其活性恢復，這些研究表明c-Jun可促進circACC1的表達，增強AMPK活性。

圖6. 在血清饑餓狀態(tài)下C-Jun促進CircACC1的表達

7.CircACC1的發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療中的意義

那么circACC1的發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療中有什么意義呢？在HCT116細胞中沉默circACC1抑制了細胞的增殖，超表達circACC1促進細胞生長。作者同時也測定了結腸癌組織及鄰近非癌組織中circACC1表達情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織circACC1的表達水平顯著高于正常組織，多數(shù)癌癥組織中c-Jun和AMPK水平也高于正常組織。百趣代謝組學文獻分享，circACC1的表達與c-Jun和AMPK的活性呈正相關。

圖7. CircACC1在腫瘤發(fā)生中的意義

總結

本研究首先篩選和鑒定與脂質代謝相關的circRNA—circACC1，代謝組方面包括用LC-MS檢測脂質代謝組及用GC-MS檢測游離脂肪酸。然后通過基因敲除試驗證實circACC1調控AMPK，進一步分析circACC1與AMPK相互作用的機理，即circACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結合。百趣代謝組學文獻分享，基因敲除試驗和哺乳動物雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)circACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性。作者還對ACC1的啟動子進行分析，發(fā)現(xiàn)c-Jun與ACC1啟動子結合，c-Jun可促進circACC1的表達。最后探索在腫瘤發(fā)生中的意義，發(fā)現(xiàn)沉默circACC1能抑制了細胞的增殖，結腸癌組織中circACC1的水平也顯著高于正常組織。百趣代謝組學文獻分享，本文研究思路嚴謹縝密，試驗設計環(huán)環(huán)相扣，層層遞進，每步都有充足的試驗驗證，工作量之大讓人嘆服，值得學習。

本次研究，BIOTREE協(xié)助老師們進行了經典脂質組學及游離脂肪酸高通量靶標定量檢測，文章的最后，老師們也對BIOTREE進行了致謝，謝謝老師們的認可，客戶的認同是BIOTREE前行最大的動力！