異硫氰酸熒光素 (FITC)?

異硫氰酸熒光素 (FITC) 是熒光素的衍生物，可用于包括流式細(xì)胞術(shù)在內(nèi)的廣泛應(yīng)用。首次描述于 1942 年，F(xiàn)ITC 是用異硫氰酸酯反應(yīng)基團(tuán) (-N=C=S) 功能化的原始熒光素分子，取代了結(jié)構(gòu)底部環(huán)上的氫原子。它通常以異構(gòu)體的混合物形式提供，即 5-異硫氰酸熒光素 (5-FITC) 和 6-異硫氰酸熒光素 (6-FITC)。 FITC 對親核試劑（包括蛋白質(zhì)上的胺和巰基）具有反應(yīng)性。它由 Robert Seiwald 和 Joseph Burckhalter 于 1958 年合成。連接到熒光素核心的琥珀酰亞胺酯官能團(tuán)形成“NHS-熒光素”，形成另一種常見的胺反應(yīng)性衍生物，在其他親核試劑存在下對伯胺具有更大的特異性。

FITC 具有大約 495 nm 和 519 nm 的激發(fā)和發(fā)射光譜峰值波長，使其呈綠色。像大多數(shù)熒光染料一樣，它容易發(fā)生光漂白。由于光漂白問題，Alexa 488 和 DyLight 488 等熒光素衍生物已針對需要更高光穩(wěn)定性、更高熒光強(qiáng)度或不同附著基團(tuán)的各種化學(xué)和生物應(yīng)用進(jìn)行了定制。此外，一些實(shí)驗(yàn)利用 FITC 的光漂白傾向，通過光漂白后的熒光恢復(fù)技術(shù)來測量蛋白質(zhì)在膜中的橫向遷移率。

異硫氰酸熒光素 (FITC) 理化性質(zhì)

中文名：異硫氰酸熒光素酯;異硫氰酸熒光素

英文名：FITC-I;5-FITC (isomer I);5,FITC;FITCFluorescein isothiocyanate isomer

CAS號：3326-32-7

SMILES：c1cc(c(cc1N=C=S)C(=O)O)c2c3ccc(cc3oc-4cc(=O)ccc24)O

Inchi：InChI=1S/C21H11NO5S/c23-12-2-5-15-18(8-12)27-19-9-13(24)3-6-16(19)20(15)14-4-1-11(22-10-28)7-17(14)21(25)26/h1-9,23H,(H,25,26)

InchiKey：IRZWHILMNSFEAF-UHFFFAOYSA-N

分子式：C21H11NO5S

分子量：389.38

閃點(diǎn)：398.7±32.9 °C

熔點(diǎn)：360°C

沸點(diǎn) ：735.6±60.0 °C at 760 mmHg

極化度：41.4±0.5 10-24cm3

密度 ：1.5±0.1 g/cm3

蒸汽壓 ：0.0±2.5 mmHg at 25°C

溶解度：丙酮（1mg/ml）；DMSO（5mg/ml）；’乙醇，微溶于水（＜0.1mg/ml）

性狀：淺黃色至棕色固體粉末

儲(chǔ)藏條件 ：-20°C，避光，在氮?dú)庀卤４?/p>

異硫氰酸熒光素 (FITC) 熒光圖譜

異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記蛋白
1.制備溶于0.1 M碳酸鈉緩沖液（pH 9）的待交聯(lián)蛋白樣品，濃度≥2 mg/mL。

【注】：a）勿將碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液存放于0-5℃超過1周，其pH值會(huì)發(fā)生變化，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。b）待標(biāo)記的蛋白必須是未被污染蛋白，且溶解蛋白的緩沖液里不能含有疊氮鈉或胺類試劑，如Tris、甘氨酸，因?yàn)檫@些試劑會(huì)抑制標(biāo)記反應(yīng)。如果緩沖液里含有上述試劑，則需將該蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析過夜；透析過程中如果pH值過高（＞8.0-8.5）會(huì)損害某些蛋白。
2. 溶解FITC于無水DMSO配制成濃度為1 mg/mL的溶液。
【注】：于標(biāo)記實(shí)驗(yàn)前新鮮配置FITC溶液，避光。
3. 對于1 mL 蛋白溶液加入50 μLFITC溶液，可按照每次5 μL的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液；
4. 待所需FITC加入完畢，將反應(yīng)液于4℃避光孵育8 h；
5. 加入NH4Cl使其終濃度至50 mM，4℃終止反應(yīng)2 h；
6. 加入二甲苯青至濃度0.1%，甘油至濃度5%； ? ? ? ??
7. 通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結(jié)合的FITC，分離范圍在20，000至50，000（球蛋白例如抗體）。待凝膠柱平衡后，將以上反應(yīng)混合液從柱頂注入，打開凝膠柱，待其全部流入柱床后，加入PBS緩沖液。
此時(shí)，可以形成兩條帶：a，快速移動(dòng)帶，也就是FITC-蛋白偶聯(lián)物，先被洗脫，通常于室內(nèi)光下可看到；b，慢速移動(dòng)帶，也就是未結(jié)合蛋白的FITC和二甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來。
8. 于4℃避光儲(chǔ)存上述偶聯(lián)物，加入0.1%（w/v）疊氮化鈉作為一種防腐劑。若蛋白濃度較低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作為一種蛋白穩(wěn)定劑。
9. 偶聯(lián)物中熒光素和蛋白的比值（F/P）可通過測定495 nm和280 nm處的吸光值來鑒定，F(xiàn)/P應(yīng)位于0.3-1.0。小于該比例則信號太低，高于該比例則背景太高。

相關(guān)案例圖示

異硫氰酸熒光素 (FITC) 標(biāo)記的 GILZ 蛋白 (GILZ-p) (10 μM) 分別刺激 Müller 細(xì)胞 6 小時(shí)和 12 小時(shí)。 通過免疫熒光評估 GILZ-p 在 Müller 細(xì)胞中的聚集。 綠色表示 FITC 標(biāo)記的 GILZ-p，藍(lán)色表示 4 個(gè) 6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色的細(xì)胞核。 比例尺：50 μm。