A. 溶液與試劑

注：利用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級(jí)別的水制備溶液。

1.1X 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：配制 1 L 的 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS至 900 ml 水，然后將其混合。

2.抗體稀釋緩沖液：購(gòu)買(mǎi)即用型流式細(xì)胞術(shù)抗體稀釋緩沖液 ，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA)來(lái)制備 0.5% BSA PBS 緩沖液。4°C 保存。

3.推薦的二抗：要檢測(cè)未偶聯(lián)的抗體，請(qǐng)選擇與一抗（例如兔）的宿主物種匹配的二抗。

注：在您的實(shí)驗(yàn)中加入熒光細(xì)胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）時(shí)，請(qǐng)參考所添加的染料產(chǎn)品頁(yè)，了解建議的實(shí)驗(yàn)步驟。

?B. 免疫染色

注：使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或備選方法計(jì)數(shù)細(xì)胞。

注：如果使用全血，則需在免疫染色之前裂解紅細(xì)胞并通過(guò)離心分離來(lái)洗滌。

注：為防止人 Fc 受體與兔 IgG 或小鼠 Fc 受體與兔或小鼠 IgG 結(jié)合，在免疫染色前用 Fc 塊預(yù)孵育活細(xì)胞。

注：理想的離心條件根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和試劑容量有所不同。一般，1-5 分鐘 150-300g 將足以使細(xì)胞沉淀下來(lái)。

1.將所需數(shù)目的細(xì)胞分裝入試管或小孔中。（通常，每次檢測(cè)用 5x10^5至 1x10^6 個(gè)細(xì)胞）。
2.通過(guò)離心使細(xì)胞沉淀下來(lái)，移除上清液。

3.在 100 μl 稀釋的一抗中重懸細(xì)胞，這種一抗按建議的稀釋度或如通過(guò)滴定所確定那樣以抗體稀釋緩沖液配制。

4.在冰上孵育 30 分鐘至 1 小時(shí)。避光。

5.在抗體稀釋緩沖液或 1X PBS 中通過(guò)離心洗滌。棄去上清液。重復(fù)。如果使用直接偶聯(lián)抗體，則跳到步驟 9。

6.在 100 μl 稀釋的熒光物質(zhì)偶聯(lián)的二抗（按建議稀釋度用抗體稀釋緩沖液制備）中重懸細(xì)胞。

7.在冰上孵育 30 分鐘。避光。

8.用抗體稀釋緩沖液進(jìn)行離心洗滌。棄去上清液。重復(fù)。

9.在 200-500 μl 抗體稀釋緩沖液中重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。

注意細(xì)節(jié)，輕松搞定實(shí)驗(yàn)

1.儀器和試劑的選擇。實(shí)驗(yàn)所用的熒光抗體的顏色，要針對(duì)已有儀器的檢測(cè)通道。不能使用儀器無(wú)法檢測(cè)的顏色。

如果是多個(gè)抗體的染色，要根據(jù)抗原的表達(dá)水平來(lái)選擇強(qiáng)度不同的熒光染料。基本原則就是表達(dá)越強(qiáng)的抗原所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度是越弱的那個(gè)熒光染料。還有就是盡量避免使用二抗，要使用已經(jīng)標(biāo)記好熒光染料的單克隆一抗來(lái)染細(xì)胞。在選擇不同的顏色時(shí)，還最好要避開(kāi)有光譜重疊較多的顏色。

2.每一個(gè)抗體在使用前都要做抗體濃度的優(yōu)化滴定，計(jì)算染色指數(shù)，找到最佳工作濃度。

3.樣本染色后要過(guò)濾（40-70微米的濾網(wǎng)），去除凝結(jié)的碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，以防堵塞機(jī)器。

4.上機(jī)時(shí)，各個(gè)樣本的細(xì)胞濃度要保持一致，所以要事先做細(xì)胞計(jì)數(shù)。