寫在前面

????????今天推薦的是由中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在2020年5月12日發(fā)表于Cell Death & Differentiation（2020IF：15.828，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Yue Zhao教授，研究表明USP22通過其去泛素化酶活性在乳腺癌中正向調(diào)節(jié)ERα作用。

研究背景

????????雌激素受體α（ERα）是ERα陽性乳腺癌進展的關(guān)鍵因素。針對ERα信號的內(nèi)分泌療法是廣泛使用的乳腺癌治療策略之一。然而，此策略難以治療部分患者。ERα共調(diào)節(jié)因子的異常表達促進了乳腺癌的發(fā)展和內(nèi)分泌抵抗的趨勢。因此，有必要發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)ERα作用的新型協(xié)同調(diào)節(jié)劑。

摘要部分

????????在這里，作者證明組蛋白去泛素化酶USP22在乳腺癌樣本中比在良性組織中高表達，并且USP22的高表達與BCa樣本中較差的總體存活率顯著相關(guān)。此外，USP22與ERα相關(guān)聯(lián)，參與維持ERα的穩(wěn)定性。USP22增強ERα誘導(dǎo)的反式激活。作者進一步提供了USP22與ERα一起被募集到ERα靶基因的順式調(diào)控元件的證據(jù)。USP22即使在缺氧條件下和ERα拮抗劑治療乳腺癌細胞時也能促進細胞生長。重要的是，USP22的去泛素化活性是維持ERα穩(wěn)定性的功能所必需的，從而增強ERα作用并賦予乳腺癌內(nèi)分泌抗性。

研究內(nèi)容

1.USP22在乳腺癌樣本中高度表達

????????據(jù)報道，USP22在多種癌癥的病理過程中起著至關(guān)重要的作用。作者進行免疫組織化學(xué)(IHC)實驗表明，與乳腺良性組織相比，USP22在BCa樣品中顯著高表達。然后作者使用組織陣列（n=124）與BCa患者和GEPIA的生存信息分析了BCa樣本中USP22表達與臨床預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果表明USP22的高表達與BCa樣品中較差的總體存活率顯著相關(guān)。作者還發(fā)現(xiàn)BCa樣品中USP22的表達與ERα的表達呈正相關(guān)。為了探討USP22和ERα表達的臨床相關(guān)性，作者在TCGA和cBio Cancer Genomics中分析了來自825名BCa患者的USP22和ESR1編碼ERα的表達相關(guān)性。有趣的是，USP22表達與4934個基因相關(guān)，11,948個基因與臨床BCa樣本中的ESR1表達相關(guān)。其中，2721個基因的表達與USP22和ESR1的表達呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，表明2721個基因可能參與了USP22調(diào)控的ERα介導(dǎo)的反式激活參與BCa的進展。

研究結(jié)論：USP22在乳腺癌組織中高表達，USP22的表達與ERα的表達呈正相關(guān)。

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2.USP22與哺乳動物細胞中的ERα相互作用

????????因此，作者轉(zhuǎn)向檢查USP22是否與細胞中的ERα相關(guān)聯(lián)。在MCF-7細胞和T47D細胞中進行免疫共沉淀(Co-IP)實驗，證明內(nèi)源性USP22與ERα批次相互作用。使用GST標(biāo)記的ERαAF1或ERαAF2表達載體進一步進行GSTPull-down實驗。結(jié)果表明ERα與USP22的結(jié)合域主要位于ERαAF2區(qū)域。使用生成的USP22突變表達質(zhì)粒（USP22HH/AA）進行Co-IP實驗，該質(zhì)粒在USP22的去泛素化酶活性中攜帶功能喪失突變。作者的結(jié)果表明ERα用USP22或USP22HH/AA沉淀，表明USP22的去泛素化酶活性不是USP22與BCa細胞中的ERα相互作用所必需的。研究USP22和ERα在BCa細胞中的亞細胞分布細胞，HEK293細胞與ERα和FLAG-USP22表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。作者觀察到，無論雌激素處理如何，USP22都分布在細胞核中。ERα主要位于沒有E2的細胞質(zhì)中。在存在E2的情況下，ERα分布在細胞核中并與USP22位于同一位置, MCF-7細胞和T47D細胞也觀察到一樣的結(jié)果?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明USP22與BCa細胞中的ERα物理相關(guān)。

研究結(jié)論：USP22與ESR1編碼的ERα相關(guān)。

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3.USP22通過觸發(fā)ERα的去泛素化來維持ERα的穩(wěn)定性

????????已經(jīng)證明USP22是去泛素化模塊的核心成分，并且USP22與細胞中的ERα相關(guān)聯(lián)，因此作者轉(zhuǎn)而研究USP22是否參與了ERα的去泛素化和維持ERα穩(wěn)定性。作者的數(shù)據(jù)顯示，在放線菌酮抑制蛋白質(zhì)合成后，USP22敲低加速了ERα降解，表明USP22保持了ERα的穩(wěn)定性。同時，與USP22對ERα蛋白的影響相比，USP22 HH/AA降低了ERα蛋白的穩(wěn)定性。進一步進行了基于免疫沉淀(IP)的泛素化分析，結(jié)果表明USP22的異位表達顯著降低了ERα泛素化水平。USP22敲低或USP22去泛素化酶失活突變體增加了ERα的泛素化，表明USP22的去泛素化酶活性是USP22對ERα去泛素化和維持ERα穩(wěn)定性的功能所必需的?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明USP22通過觸發(fā)ERα去泛素化來穩(wěn)定ERα。在不同類型的多泛素化過程中，據(jù)報道賴氨酸48(K48)和K63連接的泛素化與蛋白質(zhì)降解有關(guān)，作者接下來探究ERα上的多聚泛素鏈類型。作者的結(jié)果表明，USP22的異位表達顯著降低了K63-以及K48-連接的ERα泛素化。為了進一步研究USP22的去泛素化酶活性是否對其減少ERα上多聚泛素鏈的功能是必要的，將細胞用USP22 wt或USP22UCH突變體（USP22 HH/AA）轉(zhuǎn)染，用于使用HA標(biāo)記的Ub K48或K63進行基于IP的泛素化測定。作者的結(jié)果表明，USP22 wt切割了ERα上K48和K63連接的多聚泛素鏈，而USP22 UCH突變體則沒有。

研究結(jié)論：USP22的去泛素化酶活性是USP22對ERα去泛素化和維持ERα穩(wěn)定性的功能所必需的。

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4.USP22的去泛素化酶活性是其對ERα介導(dǎo)的反式激活的共激活功能所必需的

????????因此作者接下來探究USP22是否調(diào)節(jié)ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。熒光素酶報告基因檢測在MCF-7細胞中進行。USP22顯著增強了ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。這些結(jié)果表明USP22明顯增強了ERα作用。作者隨后探究ERα中的哪些域受USP22監(jiān)管。熒光素酶測定結(jié)果顯示USP22上調(diào)ERαAF1和ERαAF2活性。此外，作者想知道USP22對ERα作用的調(diào)節(jié)功能是否需要去泛素化酶活性。結(jié)果表明，與USP22 wt介導(dǎo)的ERα活性增強相比，USP22 HH/AA對ERα誘導(dǎo)的活性幾乎沒有影響。

????????為了探究USP22是否參與內(nèi)源性ERα靶基因的調(diào)節(jié)，進行了定量PCR(qPCR)。通過siUSP22敲低了MCF-7或BT474細胞系中的USP22。與E2存在下的對照(siCtrl)相比，USP22缺失顯著降低了ERα靶基因的mRNA表達，而USP22缺失對ERα基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響。作者還研究了USP22對一系列ERα靶基因的蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，USP22的缺失使hTERT、c-Myc和Cyclin D1的蛋白水平下降，而USP22的異位表達使其蛋白水平上升。先前的研究表明，HIF1α的表達直接受ERα的調(diào)控，HIF1α的表達與ERα+BCa的內(nèi)分泌治療的預(yù)后不佳有關(guān)。因此，作者轉(zhuǎn)而探究USP22是否在缺氧條件下調(diào)節(jié)ERα誘導(dǎo)的HIF1α表達。結(jié)果表明，USP22缺失明顯降低了缺氧條件下HIF1α的mRNA和蛋白質(zhì)表達。

研究結(jié)論：USP22增強了ERα誘導(dǎo)的反式激活，并且USP22的去泛素化酶活性對于其對ERα作用的協(xié)同調(diào)節(jié)功能是必不可少的。另一方面，USP22作為ERα的新型共激活劑，其去泛素化酶活性是USP22對ERα作用的調(diào)節(jié)功能所必需的

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5.USP22和ERα被吸收到ERα靶基因的順式調(diào)節(jié)元件

????????為了確定USP22或ERα是否被募集到雌激素反應(yīng)元件（Rα靶基因的順式調(diào)控元件）作者通過ChIP測定，數(shù)據(jù)顯示USP22或ERα被募集到c-Myc啟動子的順式調(diào)控元件。此外，USP22的異位表達顯著增加了ERα向順式調(diào)節(jié)元件的募集。同時，USP22敲低導(dǎo)致對ERα募集的減少。USP22促進ERα募集到ERα靶基因的同一區(qū)域。作者進一步研究了USP22是否與ERα一起被募集到ERα靶基因。ChIP-re-ChIP檢測在MCF-7細胞中進行。ChIP檢測首先使用來自MCF-7細胞的可溶性染色質(zhì)中針對USP22或ERα的抗體進行。然后，將來自第一個ChIP的沉淀物和上清液分別用針對第二個蛋白質(zhì)的抗體進行re-IP。數(shù)據(jù)表明USP22和ERα以組合模式作用于ERα靶基因的順式調(diào)控元件。

研究結(jié)論：USP22或ERα被募集到c-Myc啟動子的順式調(diào)節(jié)元件，且USP22和ERα以組合模式作用于ERα靶基因的順式調(diào)控元件。

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6.USP22促進ERα陽性乳腺癌細胞生長? ? ?

????????為了進一步研究USP22在BCa進展中的潛在功能，作者構(gòu)建了MCF-7細胞系，其穩(wěn)定敲低USP22或由慢病毒感染誘導(dǎo)的USP22異位表達。通過流式細胞術(shù)在MCF-7細胞中進行細胞周期分布。結(jié)果顯示USP22敲低顯著降低了MCF-7細胞和T47D細胞中S期的比例，從而抑制了細胞增殖。此外，ERα的異位表達部分逆轉(zhuǎn)了USP22敲低后S期比例的降低。這些結(jié)果表明USP22參與了細胞周期分布的調(diào)控，USP22的功能部分與ERα有關(guān)。作者進一步探究了USP22對BCa細胞系中細胞生長的影響。進行集落形成測定以確定MCF-7細胞系中的細胞增殖能力。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)USP22被敲低時，MCF-7細胞形成的集落數(shù)量低于對照細胞(shCtrl)。同時，USP22的異位表達導(dǎo)致集落數(shù)量顯著增加。然而，在ERα陰性BCa細胞系（MDA-MB-231）中，USP22缺失并未顯示出明顯的細胞增殖變化。先前已經(jīng)描述了ERα調(diào)節(jié)HIF1α途徑以賦予內(nèi)分泌抗性。隨后作者檢查了在缺氧條件下異位表達USP22的MCF-7細胞系的增殖能力。集落形成試驗表明，當(dāng)添加cocl2時，具有USP22異位表達的MCF-7細胞系形成的集落數(shù)量比對照細胞中的多?？傊?，這些結(jié)果表明，即使在缺氧條件下，USP22也能促進細胞增殖。

????????為了確定USP22對BCa細胞在體內(nèi)生長的影響，將攜帶異位表達USP22的MCF-7細胞系和對照shRNA（Ctrl）分別注射到小鼠的左側(cè)（USP22）或右側(cè)（Ctrl）。隨后，作者每周測量腫瘤的大小。相比ctrl-MCF-7細胞的腫瘤，USP22-MCF-7細胞的腫瘤尺寸，體積和四周后的重量都有明顯增大。此外，USP22-MCF-7細胞的腫瘤體積比Ctrl-MCF-7細胞的腫瘤體積表現(xiàn)出明顯的增長速度。

研究結(jié)論：USP22促進小鼠BCa細胞的生長。

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7.USP22增加乳腺癌細胞對ERα拮抗劑的抵抗力

????????針對ERα信號通路的內(nèi)分泌治療被認(rèn)為是治療ERα+BCa的潛在方法。ERα拮抗劑ICI182,780可誘導(dǎo)ERα降解并阻斷ERα介導(dǎo)的反式激活。4-Hydroxytamoxifen（他莫昔芬）作為ERα拮抗劑可抑制雌激素與ERα的結(jié)合，從而抑制ERα的作用。ERα拮抗劑ICI182,780和他莫昔芬對ERα蛋白穩(wěn)定性和ERα活性的影響。因此，作者轉(zhuǎn)而檢查USP22在MCF-7細胞、T47D細胞和他莫昔芬抗性BT474細胞中用E2和ERα拮抗劑處理對細胞生長/增殖的影響。作者的結(jié)果表明USP22敲低抑制了E2誘導(dǎo)的細胞增殖，同時USP22的異位表達增加了MCF-7細胞中E2誘導(dǎo)的細胞增殖。此外，USP22的敲低降低了ICI182,780或他莫昔芬對細胞增殖的抑制。此外，USP22的敲低增強了BT474細胞對他莫昔芬的敏感性，并且當(dāng)MCF-7細胞用USP22轉(zhuǎn)染時，細胞變得對他莫昔芬更具抗性。

研究結(jié)論：USP22增加了MCF-7、T47D或BT474細胞對拮抗劑的抵抗力。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者的研究表明,USP22作為ERa蛋白水平的調(diào)節(jié)劑與ERa結(jié)合，參與ERa的K48和K63連接的Ub鏈的去泛素化,從而抑制ERα降解。另一方面， USP22作為ER信號傳導(dǎo)的一個新的共激活器出現(xiàn)，從而促進BCa的細胞生長和增殖。這些結(jié)果支持這樣一個概念，即USP22是BCa進展的主要驅(qū)動因素，也是BCa和內(nèi)分泌抗性的潛在治療目標(biāo)。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41418-020-0568-2