前段時間，賽業(yè)生物產(chǎn)品經(jīng)理劉凡瑞主講的「Cre工具鼠系統(tǒng)在實際應(yīng)用場景中的問題與思考」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。

FAQ:

1.Cre-loxp技術(shù)具體工作原理及應(yīng)用？

2.如何判斷Cre工具鼠的基因型？

3.平常實驗中Cre工具鼠的特異性鑒定手段及敲除效果如何判斷？

4.什么是雌激素誘導(dǎo)型Cre，CreER、CreERT、CreERT2和MerCreMer有什么區(qū)別？

5.Cre工具鼠的實驗設(shè)計及構(gòu)建方法？

Q

Cre-loxp技術(shù)具體工作原理及應(yīng)用？

A

源自P1噬菌體的Cre-lox系統(tǒng)是控制基因表達(dá)的有效特異性系統(tǒng)，由Cre重組酶和loxP位點組成。loxP的反向序列是Cre重特異性酶識別的位點，loxP的間隔序列決定其方向性及重組的結(jié)果。

倒置：如果loxP位點位于同一DNA鏈上并且方向相反，則重組會導(dǎo)致loxP位點之間的DNA區(qū)域被反轉(zhuǎn)。

刪除：如果loxP位點朝向同一方向，則loxP位點之間的序列被切除為環(huán)狀DNA片段（并且不被保留）。

易位：如果這些位點位于單獨的DNA分子上，則在loxP位點產(chǎn)生易位事件。

Q

如何判斷Cre工具鼠的基因型？

A

Cre工具鼠本質(zhì)是敲入鼠，需要結(jié)合配繁方案判斷基因型。例如定點敲入的Cre工具鼠在與其他小鼠配繁后會出現(xiàn)基因型分離，通過PCR鑒定可以判斷純雜合；如果是TG打靶的Cre工具鼠，一般只能檢測到陽性條帶，不能判斷純雜合。

Q

平常實驗中Cre工具鼠的特異性鑒定手段及敲除效果如何判斷？

A

Cre鼠有通用引物及特異性引物，我們更推薦使用特異性引物進(jìn)行鑒定。敲除的效果需要注意取材，根據(jù)工具鼠表達(dá)的部位取材，通過PCR鑒定來判斷基因型，通過qPCR來判斷剪接后的表達(dá)量，通過WB、IF、IHC等手段判斷敲除后的蛋白表達(dá)情況。

Q

什么是雌激素誘導(dǎo)型Cre，CreER、CreERT、CreERT2和MerCreMer有什么區(qū)別？

A

雌激素誘導(dǎo)型Cre是通過將雌激素受體（estrogen receptor，ER）的配體結(jié)合區(qū)與Cre重組酶相融合，形成定位于細(xì)胞質(zhì)中的融合蛋白（Cre-ER）。在無雌激素誘導(dǎo)劑情況下，其與細(xì)胞質(zhì)中HSP90結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)，無法發(fā)揮Cre-loxP重組系統(tǒng)作用。在雌激素誘導(dǎo)后，融合的Cre蛋白才會通過構(gòu)象變化從錨定蛋白HSP90上解離下來，進(jìn)入細(xì)胞核，識別基因組上的loxp位點并發(fā)生重組。這樣就通過控制雌激素的注射時間，可以實現(xiàn)對基因重組時間特異性的調(diào)控。

A

Cre-ER是將人類雌激素受體ER結(jié)合區(qū)與Cre重組酶相融合的誘導(dǎo)Cre。有可能會因動物本身分泌的雌激素影響。為了避免內(nèi)源性的雌激素的干擾，研究者改造出一種配體結(jié)合區(qū)發(fā)生突變的Cre-ERT（G521R），其使Cre-ER只響應(yīng)外源的人工合成雌激素（Tamoxifen等）。后面研究者又發(fā)現(xiàn)另一種配體結(jié)合區(qū)包含3個點突變的Cre-ERT2（C400V/M453A/L544A），具有遠(yuǎn)高于Cre-ERT的敏感性。MerCreMer由Cre重組酶與兩側(cè)各有一個突變的鼠雌激素受體 （mer）配體結(jié)合域（氨基酸281-599，G525R）組成，可以降低未加藥就進(jìn)入胞核的概率，避免提前泄露。

Q

Cre工具鼠的實驗設(shè)計及構(gòu)建方法？

A

Cre工具鼠傳統(tǒng)的方法就是通過TG打靶，將Cre隨機插入到小鼠體內(nèi)，如果需要包含更多基因表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件序列的話則使用BAC轉(zhuǎn)基因的方式。這種方式簡單直接，目的就是在小鼠體內(nèi)表達(dá)Cre酶，缺點就是不能確定打靶位置，這就可能導(dǎo)致flox與Cre在同一條染色體上，那就無法獲得重組后的純合子。隨機插入還會導(dǎo)致其他基因片段被破壞引起小鼠的致死或則異常。隨著基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在多數(shù)可以進(jìn)行精準(zhǔn)打靶，通過將Cre基因定點敲入相關(guān)內(nèi)源基因位點，依靠內(nèi)源性基因調(diào)控序列確定Cre表達(dá)特征。如果不想破壞內(nèi)源基因，則可以選擇Rosa26、H11這樣的安全位點敲入Cre。

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