前言

2022年3月21日，中山大學(xué)附屬第一院器官移植中心高伊?xí)P教授及何曉順教授與暨南大學(xué)附屬珠海市人民醫(yī)院吳揚(yáng)哲教授、尹芝南教授及陸驪工教授等合作，在Clinical and Translational Medicine（IF:11.492）發(fā)表了肝細(xì)胞癌單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)的研究。該篇文章中，中山大學(xué)附屬第一院何文靖博士與暨大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院胡怡副教授為共同一作，歐易生物提供了該篇文章的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析工作。

材料：肝臟灌洗液

期刊：Clinical and Translational Medicine

發(fā)表時(shí)間：2022年3月21日

方法：歐易生物10× Genomics scRNA-seq

研究背景

原發(fā)性肝癌以肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）為主。在全球范圍內(nèi)，HCC是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大常見(jiàn)原因，在發(fā)病率方面排名第六。鑒于HCC對(duì)傳統(tǒng)化療藥物易產(chǎn)生治療抵抗，免疫治療在HCC中備受期待。γδ T細(xì)胞能夠特異性靶向腫瘤細(xì)胞而不傷及正常細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)引起研究者們極大關(guān)注，而γδ T細(xì)胞浸潤(rùn)的有效性可能與HCC的進(jìn)展和患者的預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步研究觀察到，γδ T細(xì)胞在HCC中的浸潤(rùn)程度低于腫瘤周圍組織。有趣地是，作者還在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，Vδ2 T細(xì)胞治療可以顯著減緩患者HCC進(jìn)展。然而，γδ T細(xì)胞在HCC腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment, TME）和正常肝組織中的功能差異仍不清楚。因此，為進(jìn)一步表征和區(qū)分浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞的免疫異質(zhì)性圖譜，并揭示其功能復(fù)雜性和在HCC中的轉(zhuǎn)化演變，作者收集HCC患者以及健康人肝灌洗液進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，為未來(lái)治療HCC免疫療法提供參考。

內(nèi)容概述

作者使用磁珠富集來(lái)自HCC患者和健康人肝灌洗液中的CD3CD161 T細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC患者中具有一群表達(dá)細(xì)胞毒性但接近耗竭狀態(tài)的γδ T亞群，進(jìn)一步針對(duì)該亞群進(jìn)行功能富集以及擬時(shí)序等分析，發(fā)現(xiàn)該亞群LAG3耗竭標(biāo)記基因以及谷氨酰胺等相關(guān)代謝通路顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖等相關(guān)通路下調(diào)，細(xì)胞周期停滯在G2/M期。進(jìn)一步分析該亞群TCR多樣性與克隆型，發(fā)現(xiàn)相比健康對(duì)照組HCC組明顯丟失。作者將以上結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)來(lái)自健康供者的Vδ2 T體外擴(kuò)增后能夠挽救HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞的功能和代謝缺失。

研究?jī)?nèi)容解析

浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞聚類及亞型分析

作者首先從HCC患者和健康人肝灌洗液中富集CD3CD161 T細(xì)胞，接著針對(duì)富集得到的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序(圖1A)，并根據(jù)TRDC從測(cè)序結(jié)果中鑒定出γδ T細(xì)胞，進(jìn)一步將γδ T細(xì)胞群降維聚類得到6個(gè)亞群(圖1B)。對(duì)γδ T亞群樣本來(lái)源進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)C4幾乎全部來(lái)源于HCC患者(圖1C)。針對(duì)各亞群進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)在top10差異基因中，C4高表達(dá)耗竭性標(biāo)記基因LAG3以及毒性標(biāo)記基因NKG7、GNLY、GZMB和IFNG，表明該亞群在HCC中具有細(xì)胞毒性但接近耗竭的特點(diǎn)。此外，作者發(fā)現(xiàn)，C0、C1、C2、C3均主要分布在健康肝臟中，分別表達(dá)效應(yīng)記憶T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞等標(biāo)記物，C5僅在健康肝臟中檢測(cè)到，并且高表達(dá)na?ve T細(xì)胞標(biāo)記物(圖1D, E)。這些結(jié)果表明，HCC患者相比于健康人的γδ T細(xì)胞亞群其多樣性發(fā)生丟失。進(jìn)一步針對(duì)各亞群差異基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)C4中谷氨酰胺代謝和凋亡通路顯著上調(diào)，TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、中心代謝途徑（例如：糖酵解、氧化磷酸化）下調(diào)，提示HCC內(nèi)γδ T 細(xì)胞的代謝重編程和效應(yīng)功能的丟失(圖1F, G)。

圖1 | 單細(xì)胞測(cè)序分析HCC和健康肝臟中腫瘤浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞

HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞TCR多樣性發(fā)生丟失

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，TCR多樣性與腫瘤進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。作者從單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果觀察到，與健康肝臟相比，HCC肝臟中TRDC γδ T細(xì)胞顯著減少(圖2A)，TCR（TRGV）多樣性明顯丟失(圖2B)。同時(shí)，γδ T細(xì)胞TRGV、TRGC、TRDV變體在各亞群中的表達(dá)證明了C4中TCR多樣性普遍丟失(圖2C)。TCR克隆型分析結(jié)果表明，C4中超過(guò)69%的細(xì)胞都只能檢測(cè)到一個(gè)TCR克隆型(圖2D)。作者將單細(xì)胞結(jié)果HCC γδ T與已發(fā)表的γδ T細(xì)胞分類：Vδ1和Vδ2(分別記為基因集1和基因集2)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞與Vδ1的表達(dá)譜更為接近(圖2E)。然而，Vδ1和Vδ2總體基因集活性都低于健康組，這表明TCR多樣性在HCC中總體丟失。進(jìn)一步利用激光共聚焦顯微鏡在HCC和癌旁組織切片中觀察浸潤(rùn)性Vδ1和Vδ2 γδ T細(xì)胞，同樣發(fā)現(xiàn)HCC浸潤(rùn)性Vδ2 γδ T細(xì)胞減少(圖2F)。此外，作者還利用HCC患者和健康人的肝灌洗液，基于Th1、Th2和Th17趨化因子的表達(dá)CD183 (CXCR3)和CD196 (CCR6)分析γδ T亞型，流式分析結(jié)果表明HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞中Th1群體顯著減少，意味著細(xì)胞毒性功能的丟失(圖2G)。前期文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Vδ2表現(xiàn)為毒性(Th1樣)亞型，而Vδ1在腫瘤發(fā)展中的作用仍存在爭(zhēng)議。作者的研究結(jié)果表明，在HCC中，γδ T細(xì)胞的毒性被削弱，而TCR多樣性的丟失可能導(dǎo)致γδ T細(xì)胞功能多樣性的丟失以及在TME中的應(yīng)答能力的丟失。

圖2 | TCR多樣性及克隆型分析

γδ T細(xì)胞的發(fā)育軌跡

為了分析γδ T的發(fā)育軌跡，作者根據(jù)na?ve T、毒性T以及耗竭T的基因標(biāo)記物(圖3A)，結(jié)合γδ T各亞群top10差異基因，發(fā)現(xiàn)在擬時(shí)序軌跡中，以C5（na?ve T）作為起始點(diǎn)，分為兩支，其中一支向效應(yīng)T及記憶T分化，而另一支向C4（耗竭T）分化，與前文得到的結(jié)論相符(圖3B, C, D)。針對(duì)擬時(shí)序中的高變基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Cell fate1(即向C4耗竭T轉(zhuǎn)變分支)中耗竭標(biāo)記基因如LAG3表達(dá)逐漸升高。同時(shí)對(duì)γδ T各亞群的代表基因進(jìn)行動(dòng)力學(xué)趨勢(shì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C4中的代表性基因LAG3逐漸升高（實(shí)線代表Cell fate1，虛線代表Cell fate2）(圖3E,F)。以上結(jié)果表明，在HCC中，浸潤(rùn)性γδ T逐漸趨向耗竭。

圖3 | 擬時(shí)序分析γδ T細(xì)胞發(fā)育軌跡

HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞G2/M期受到阻滯

為進(jìn)一步了解HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞多樣性丟失是否導(dǎo)致TME中T細(xì)胞增殖受限和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作者比較了γδ T各亞群中凋亡相關(guān)通路表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C4高表達(dá)細(xì)胞凋亡相關(guān)通路，表明C4中的細(xì)胞在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡(圖4A)。針對(duì)γδ T細(xì)胞進(jìn)行組間GSVA，以及針對(duì)C4與其他γδ T亞群進(jìn)行GSVA分析，分析結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞增殖能力下調(diào)，而T細(xì)胞向Th2，Th17和調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）分化的通路上調(diào)(圖4B)。進(jìn)一步分析γδ T各亞群的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，C4中接近60%的γδ T細(xì)胞處于G2/M期，而其他亞群中的γδ T細(xì)胞則主要處于G1期(圖4C)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，在調(diào)控細(xì)胞周期G2/M期的分子中，與GADD45家族蛋白相互作用可能導(dǎo)致G2/M期停滯。因此，作者進(jìn)一步觀察γδ T細(xì)胞各亞群以及HCC與健康人中細(xì)胞周期相關(guān)基因的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正向調(diào)控細(xì)胞周期因子例如CCNH和CCND3表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期停滯相關(guān)基因例如GADD45家族以及PCNA上調(diào)(圖4D)。以上研究結(jié)果表明，腫瘤浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞G2/M期發(fā)生停滯，這可能導(dǎo)致HCC TME受到免疫抑制。

圖4 | 細(xì)胞各亞群細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)

HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，但呈現(xiàn)出末端耗竭狀態(tài)

作者進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平研究細(xì)胞毒性和抑制分子的表達(dá)。HCC和健康人中的γδ T細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞毒性分子和細(xì)胞因子基因(圖5A)。使用流式細(xì)胞術(shù)分析健康人外周血與HCC患者外周血中的γδ T細(xì)胞，以及健康人和HCC患者浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HCC肝臟中γδ T細(xì)胞相比健康肝臟中γδ T細(xì)胞明顯減少，而在兩者的外周血中γδ T細(xì)胞比例相當(dāng)(圖5B)。此外，無(wú)論在浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞中還是外周血中，細(xì)胞毒性分子(IFN-γ, TNF-α)表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但在HCC肝臟中顆粒酶B表達(dá)顯著增加(p = .0114)，這與作者上述單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果相符(圖5B)。同時(shí)，作者還針對(duì)HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞與健康人中的γδ T細(xì)胞進(jìn)行差異分析，從火山圖以及熱圖結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，LAG3在HCC中高表達(dá)(圖5C, D)，同樣在蛋白水平上也進(jìn)行了驗(yàn)證，得到同樣的結(jié)論(圖5E)。此外，HCC和癌旁組織切片的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有γδ T細(xì)胞(Vδ1和Vδ2)都強(qiáng)表達(dá)LAG3(圖5F)。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果也表明，在HCC TME中，Vδ2 γδ T細(xì)胞數(shù)量少于Vδ1+ γδ T細(xì)胞。值得注意的是，HCC外周血中γδ T細(xì)胞與健康對(duì)照組相比，LAG3蛋白表達(dá)水平?jīng)]有上調(diào)(圖5E)。以上結(jié)果提示，LAG3介導(dǎo)HCC TME中浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞抑制和耗竭機(jī)制。

圖5?| γδ T細(xì)胞中毒性分子、細(xì)胞因子、趨化因子及耗竭相關(guān)基因表達(dá)

HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞代謝行為發(fā)生巨大轉(zhuǎn)變

在γδ T細(xì)胞亞群富集結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)C4中谷氨酰胺代謝通路顯著上調(diào)，中心代謝途徑下調(diào) (圖1F, G)，因此，作者進(jìn)一步關(guān)注HCC TME中γδ T細(xì)胞代謝途徑的改變。效應(yīng)T細(xì)胞功能相關(guān)通路例如糖酵解，氧化磷酸化，脂肪和氨基酸代謝通路顯著下調(diào)，而谷氨酰胺代謝及其相關(guān)通路，如氮、精氨酸和脯氨酸代謝在HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞中上調(diào)(圖6A, cluster 4)。對(duì)來(lái)自健康人供者中的γδ T細(xì)胞體外擴(kuò)增后進(jìn)行bulk RNA測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵代謝基因表達(dá)模式與來(lái)自HCC或者健康肝臟中的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)具有很強(qiáng)的相關(guān)性(圖6B)。

HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞表現(xiàn)為L(zhǎng)AG3依賴性功能障礙

上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC中LAG3表達(dá)顯著升高，結(jié)合HCC中谷氨酰胺代謝顯著上調(diào)，作者提出猜想：HCC浸潤(rùn)性γδ T 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LAG3可能會(huì)導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞代謝表型受到抑制。流式分析評(píng)估培養(yǎng)基中缺乏谷氨酰胺對(duì)體外擴(kuò)增的Vδ2 T 細(xì)胞效應(yīng)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAG3在谷氨酰胺限制狀態(tài)下，表達(dá)明顯升高(圖6C, F)。此外，在谷氨酰胺缺乏的培養(yǎng)基中觀察到IFN-γ和TNF-α表達(dá)水平下降(圖6C)。作者還使用了transwell培養(yǎng)HCC細(xì)胞系與γδ T細(xì)胞系，模擬谷氨酰胺在TME中的競(jìng)爭(zhēng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在transwell共培養(yǎng)條件下LAG3的表達(dá)也上調(diào)，與scRNA-seq結(jié)果一致(圖6D)。同時(shí)觀察到，在transwell中另兩種抑制分子PD1和TIM-3的表達(dá)水平也升高(圖6D)。作者進(jìn)一步使用兩種谷氨酰胺代謝抑制劑：AAA和CB839，分別抑制谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酰胺酶(GLS1)的活性。流式分析顯示AAA抑制γδ T細(xì)胞中谷氨酰胺的合成，逆轉(zhuǎn)了谷氨酰胺缺乏培養(yǎng)基中LAG3的表達(dá)，用CB839阻斷谷氨酰胺整體分解代謝也表現(xiàn)出類似的結(jié)果。這意味著在細(xì)胞外谷氨酰胺限制條件下，LAG3的表達(dá)上調(diào)是由于細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺代謝途徑上調(diào)。TIM-3也觀察到了類似的結(jié)果，但PD-1沒(méi)有(圖6E)。使用Luminex 34-Plex試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子/趨化因子，結(jié)果表明，在體外谷氨酰胺剝奪條件下，促炎因子（包括IFN-γ、MIP1a、MIP1b、IL-8、IL-13和GM-CSF）的表達(dá)水平在24h內(nèi)增加，在72h降低。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，γδ T細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于谷氨酰胺缺乏的TME中可能削弱其分泌促炎因子的能力。

圖6?| HCC中腫瘤浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞(C4)與其他健康肝臟中駐留的γδ T細(xì)胞相比，

代謝途徑發(fā)生轉(zhuǎn)變

體外擴(kuò)增Vδ2 γδ T細(xì)胞挽救HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞TCR多樣性丟失以及效應(yīng)功能失調(diào)

作者此前的研究證明，從健康供者PBMC中擴(kuò)增的Vδ2 γδ T細(xì)胞對(duì)于包括HCC在內(nèi)的晚期癌癥有良好的治療前景。在前期實(shí)驗(yàn)中觀察到輸注的Vδ2 T細(xì)胞能夠迅速遷移到腫瘤部位并積累。因此，體外擴(kuò)增Vδ2 T細(xì)胞能否挽救HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞TCR多樣性丟失以及效應(yīng)功能失調(diào)，是作者十分關(guān)注的一點(diǎn)。為了解決這一疑惑，作者對(duì)來(lái)自三位健康供者PBMCs中擴(kuò)增得到的Vδ2 T進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序(圖7A)。針對(duì)擴(kuò)增的Vδ2 T細(xì)胞與HCC來(lái)源的細(xì)胞的TCR多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TCR主要富集在擴(kuò)增的Vδ2 T細(xì)胞中(圖7B)。進(jìn)一步針對(duì)γδ T細(xì)胞進(jìn)行擬時(shí)序分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的Vδ2 T細(xì)胞分化軌跡展現(xiàn)出分支結(jié)構(gòu)，這表明其功能和分化的多樣性，而在HCC樣本中沒(méi)有觀察到這一點(diǎn)(圖7C)。細(xì)胞代謝GSVA結(jié)果顯示，與HCC來(lái)源的γδ T細(xì)胞相比，擴(kuò)增的Vδ2 T細(xì)胞富集了主要代謝途徑，如氧化磷酸化、糖酵解和脂肪酸代謝(圖7D)。進(jìn)一步進(jìn)行GSVA分析比較擴(kuò)增Vδ2 T細(xì)胞與HCC樣本中γδ T細(xì)胞毒性基因，結(jié)果顯示，擴(kuò)增Vδ2 T細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)分高于HCC樣本(圖7E)，這意味著細(xì)胞毒性效應(yīng)功能缺失的潛在互補(bǔ)。最后，基因表達(dá)水平顯示LAG3主要在HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞中表達(dá)，而非HCC外周來(lái)源的γδ T細(xì)胞(圖7F)。這些結(jié)果表明，體外擴(kuò)增的Vδ2 γδ T細(xì)胞可以挽救HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞抗腫瘤功能的缺失，也支持了體外擴(kuò)增的Vδ2 γδ T細(xì)胞治療HCC的潛力。

圖7 | HCC中腫瘤浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞(C4)與其他健康肝臟中駐留的γδ T細(xì)胞相比，代謝途徑發(fā)生轉(zhuǎn)變

研究結(jié)論

這篇文獻(xiàn)的作者通過(guò)比較HCC患者和健康人肝灌洗液中的γδ T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HCC患者中具有一群獨(dú)特的γδ T亞群，進(jìn)一步針對(duì)該亞群進(jìn)行功能富集分析、擬時(shí)序分析、細(xì)胞周期等分析，發(fā)現(xiàn)該亞群LAG3耗竭標(biāo)記基因以及谷氨酰胺等相關(guān)代謝通路顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖等相關(guān)通路下調(diào)，細(xì)胞周期停滯在G2/M期。此外，該亞群TCR多樣性與克隆型相比健康對(duì)照組HCC組明顯丟失。通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺可能參與LAG3介導(dǎo)的HCC TME免疫抑制，使得HCC中γδ T TCR多樣性丟失，導(dǎo)致其功能以及應(yīng)答能力的丟失。作者還發(fā)現(xiàn)來(lái)自健康供者的Vδ2 T體外擴(kuò)增后能夠挽救HCC浸潤(rùn)性γδ T細(xì)胞的功能和代謝缺失，這為未來(lái)HCC免疫治療提供重要的參考。

參考文獻(xiàn)：

1.He W, Hu Y, Chen D, et al. Hepatocellular carcinoma-infiltrating γδ T cells are functionally defected and allogenic Vδ2 γδ T cell can be a promising complement. Clin Transl Med. 2022;12(4):e800. doi:10.1002/ctm2.800

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