體外轉(zhuǎn)錄（IVT）mRNA在腫瘤免疫和靶向的治療效果已聞名遐邇。隨著納米遞送技術的進步，可以克服治療性mRNA傳遞到真核細胞的障礙，COVID-19 IVT mRNA疫苗的大規(guī)模臨床應用已成為經(jīng)典案例。

真核生物mRNA翻譯主要是甲基鳥苷（m7G）“帽”依賴翻譯起始的。而有一種翻譯是利用內(nèi)部核糖體進入位點（IRES）的順式調(diào)節(jié)元件來啟動翻譯，如脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）等等。

mRNA編碼凋亡相關的毒性分子來產(chǎn)生治療性溶瘤蛋白，如半胱天冬酶、PUMA和MLKL等等。研究發(fā)現(xiàn)，溶瘤蛋白具有形成孔的能力，導致膜細胞溶解并引發(fā)炎癥焦亡，其中以氣體D（GSDMD）效果最佳。GSDMDNT作為一種溶解腫瘤細胞的內(nèi)源性分子，具有獨特的優(yōu)勢：

(1)分子量?。?1 kDa）和蛋白質(zhì)構象簡單，便于工程修飾和傳遞；

(2)具有嚴格的自抑制機制（但一旦激活，GSDMD具有較強的膜裂解能力）；

(3) GSDMD具有胞膜內(nèi)靶向的特異性，即GSDMDNT破裂后不能破壞鄰近細胞，從而控制細胞毒性[1]。

如何將新一代技術融合用于解決癌癥問題，需要更多人參與。

2023年10月16日，新加坡A*STAR及國立大學陳小元/東南大學及南京醫(yī)科大學夏洪平/皖南醫(yī)學院江曉春團隊在Nature Cancer(IF=22.7)發(fā)表文章“An in vitro-transcribed circular RNA targets the mitochondrial inner membrane cardiolipin to ablate EIF4G2+/PTBP1+ pan-adenocarcinoma”。

本研究利用內(nèi)含子-外顯子（PIE）剪接環(huán)化策略和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）包裝方法（二者能降低mRNA的免疫原性），將人鼻病毒2型（HRV2）內(nèi)部核糖體進入位點(IRESs，可觸發(fā)序列在癌細胞 (EIF4G2 和 PTBP1高表達）中翻譯)，hGSDMDc .825 T>A/c.884 A>G-F1LCT突變mRNA序列（具備線粒體內(nèi)膜心磷脂靶向毒性，觸發(fā)線粒體吞噬，溶解并殺傷腫瘤細胞），組裝成GSDMDENG環(huán)狀RNA。體內(nèi)實驗結果顯示，GSDMDENG環(huán)狀RNA可抑制EIF4G2+ /PTBP1+泛腺癌的發(fā)展。并且，非常值得關注的是，在KRASG12D突變引起EIF4G2和PTBP1異常的腫瘤模型中，GSDMDENG環(huán)狀RNA可顯著抑制胰腺、肺和結腸腺癌的發(fā)生，提高了生存率，誘導了KRASG12D腫瘤抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞反應。

GSDMDNT IVT mRNA引發(fā)心磷脂膜毒性

eIF4G2和PTBP1高表達于腫瘤組織中，其活躍表達可幫助IRES驅(qū)動IVT mRNA的表達，以實現(xiàn)腫瘤的基因靶向（圖1a，b）。為了鑒定可驅(qū)動表達的IRES，作者構建了四種病毒（HRV2、EMCV、PV_type1_Mahoney和PV_type3_Leon）的IRES雙反子IVT-mRNA報告系統(tǒng)。最終結果顯示，來自HRV2的IRES在eIF4G2+/PTBP1+腫瘤細胞中表現(xiàn)出選擇性表達，此IRES選作后續(xù)實驗（圖1d）。

GSDMD的N端可插入內(nèi)膜，以肌醇和心磷脂為目標，形成孔，從而破裂質(zhì)膜。為了選擇性地誘發(fā)癌細胞的膜毒性，作者組裝由HRV2 IRES驅(qū)動的GSDMDNT IVT mRNA（圖1e）。為了消除真核細胞內(nèi)內(nèi)源性GSDMD表達和其他IFs/ITAFs的干擾，作者構建了原核細胞表達和純化系統(tǒng)。通過電轉(zhuǎn)染將GSDMDNT IVT mRNA和過表達質(zhì)粒pAOX1-EIF4G2和pHT43-PTBP1導入富含心磷脂的枯草芽孢桿菌中。結果顯示，eIF4G2+/PTBP1+腫瘤細胞中，HRV2 IRES可以驅(qū)動原核細胞中GSDMDNT mRNA的表達，誘導心磷脂膜毒性（圖1f-i）。

LNPs將GSDMDNT IVT mRNA傳遞到eIF4G2+/PTBP1+癌細胞

使用微流控芯片裝置，按照DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和peg-脂質(zhì)的標準脂質(zhì)配方將HRV2 IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs封裝在LNPs中（平均直徑為100nm），隨后遞送到eIF4G2+/PTBP1+癌細胞系，以誘導GSDMD依賴性的焦亡（圖2a-d）。

與m7G的GSDMDNT mRNA相比，HRV2 IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs可以有效地、有選擇性地轉(zhuǎn)化為GSDMDNT，并且HRV2 IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs不足以引發(fā)癌細胞毒性，安全性良好（圖2e-f）。這可能與ESCRT機制有關，該機制通過質(zhì)膜修復機制逃避細胞死亡。

為了驗證這一假設，遞送后，作者觀察到了ESCRT-III招募受損癌細胞膜上的CHMP4A和TSG101，這提示轉(zhuǎn)染GSDMDNT mRNA-LNPs啟動了ESCRT修復和死亡逃逸（圖2h）。作者構建了CHMP4A?/?的癌細胞模型（可消除ESCRT的修復)。但是，較低劑量（-10 ng）的IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs即可啟動CHMP4A?/?癌細胞的細胞毒性。因此，需要進一步的修飾，以使其適應與ESCRT機制相關的癌細胞死亡逃逸。

線粒體傳遞以逃避ESCRT介導的死亡

真核細胞的mIM是唯一富含心磷脂的亞細胞細胞器，在mIM中尚未觀察到有效的ESCRT修復機制。作者欲將GSDMDNT靶向于線粒體心磷脂，通過線粒體損傷觸發(fā)細胞死亡。

作者設計三個N端線粒體靶向序列（N/MTSs）來靶向線粒體基質(zhì)（mM）、mIM和線粒體膜間空間（mIS）。結果顯示，mM/MTS和mIS/MTS修飾可使GSDMDNT能夠?qū)刖€粒體。不過，N/MTS-GSDMDNT并沒有表現(xiàn)出心磷脂膜毒性。但是，作者在293T細胞中發(fā)現(xiàn)，N/MTS肽與含有L192氨基酸位點的GSDMDNT-α4多肽段有特異性結合。因此，作者猜測N/MTS干擾了GSDMDNT在膜插入和孔形成活性位點（L192/E15）期間的蛋白構象。為了保證GSDMDNT的構象活性，作者決定修改方案為修飾其C端信號肽。

牛痘病毒F1L蛋白的C端包含一個疏水結構域，其兩側是帶正電荷的殘基（28個氨基酸），有助于將牛痘病毒蛋白靶向到線粒體上。F1LCT肽不與GSDMDNT的活性中心結合。然而，GSDMDNT與F1L的C端連接（GSDMDNT-F1LCT）卻能保留GSDMDNT心磷脂膜毒性（圖3a-e）。經(jīng)過設計，最終，在LNP中包裹HRV2 IRES-GSDMDNT-F1LCT mRNA，既能啟動GSDMDNT的表達，又能促進其轉(zhuǎn)位到線粒體（圖3g）。在轉(zhuǎn)染GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs的AsPC-1癌細胞中，共聚焦顯微鏡顯示GSDMDNT的線粒體形態(tài)和定位。相比之下，在非癌細胞中，線粒體中GSDMDNT的熒光強度較低，線粒體的完整性未受到明顯影響，提示HRV2 IRES-GSDMDNT-F1LCT mRNA對線粒體的破壞作用（圖3g）。

流式細胞檢測線粒體碎片發(fā)現(xiàn)GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs處理后，體積更小（<1μm）（圖3h）。從線粒體泄漏的細胞質(zhì)mtDNA和mtROS分別導致pRIP-MLKL和STING-TBK1-IRF-3信號通路的激活（促進腫瘤消融）（圖3i-k），再度提示GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs抑制腫瘤生長的作用。不過使用Necrox-5（抑制mtROS）和EtBr（抑制mtDNA）可以有效地阻礙這一過程。此外GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs也可促進LAMP1+溶酶體對AsPC-1細胞線粒體的吞噬，誘導線粒體吞噬。

綜上結果表明，GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs通過形成穿孔損害線粒體，并且通過刺激MLKL信號通路和線粒體自噬，抑制腫瘤生成。

通過GSDMD突變賦予線粒體觸發(fā)特性

雖然GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs在非癌細胞系中沒有引起嚴重的線粒體滲漏或質(zhì)膜毒性，但它們影響了亞細胞，如減少溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這可能是磷脂酰肌醇磷酸介導的（圖4a，b）。為了減少GSDMD的非特異性亞細胞器膜毒性，作者在其mRNA中引入點突變（hGSDMD），使其在癌細胞中亞細胞器選擇性地釋放蛋白水解毒性產(chǎn)物。

hGSDMD在細胞質(zhì)中275處的天冬氨酸殘基（D275）處被半胱氨酸/天冬氨酸水解酶切割成GSDMDNT和GSDMDCT。GSDMDCT的獨特結構可抑制GSDMDNT在磷脂質(zhì)膜上的異常成孔活性。作者突變了D275位點(GSDMD p.D275E（c.825 T > A）)，剝奪了半胱天冬酶的水解位點，并限制了GSDMD在細胞質(zhì)中的亞細胞細胞器毒性（圖4c）。

線粒體加工肽酶（PMPCB）是位于mM中的一個β亞基，其中包含一個兩親性的α-螺旋底物綁定空腔,可選擇性地識別Phe/Leu/Ile-XX-Ser/Thr/Gly-XXXX底物位點，并在Ser位點進行切割，促進線粒體中核編碼蛋白的正確折疊和成熟[2]。根據(jù)GSDMD33的晶體結構，作者發(fā)現(xiàn)GSDMDCT的α1連接螺旋（18個氨基酸）可以轉(zhuǎn)化為PMPCB的裂解結構域，PMPCB由兩個四螺旋重復序列組成：-I（α2-α5）和-II（α6-α7，α9-α10）。這個域形成了一個緊湊的球形褶皺，在空間上被PMPCB識別。另一方面，α8結構太短（只有9個氨基酸），無法終止結構自抑制。為了克服這一限制，作者在突變D275位點的基礎上，又創(chuàng)建了hGSDMD c.884 A > G突變體（編碼p.E295G的突變株）。該突變理論上可以被PMPCB識別，并具有肽酶底物活性（圖4c）。雙突變體GSDMD p.D275E/p.E295G（GSDMDENG）獲得PMPCB水解底物活性，在體外可被重組hPMPCB裂解成GSDMDNT和GSDMDCT（圖4d，e）。

被裂解的hGSDMDENG產(chǎn)物具有針對心磷脂膜的毒性作用（圖4f，g）。在轉(zhuǎn)染了LNP封裝的HRV2 IRES-LNP-F1LCTmRNA的真核腫瘤細胞中顯示出線粒體特異性的切割活性，即GSDMDNT只能在癌細胞的線粒體中檢測到（圖4h）。GSDMDENG不影響非腫瘤細胞系中溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量，但GSDMDENG誘導腫瘤細胞線粒體碎片，并可抵制ESCRT修復（圖4i、j）。并且，重要的是，與GSDMDNT mRNA在癌細胞和非癌細胞中的半抑制濃度相比，HRV2 IRES-GSDMDENG-F1LCTmRNA-LNPs在較低劑量下表現(xiàn)出安全的癌細胞抑制活性（圖4k，6g）。

轉(zhuǎn)基因IVT mRNA的自剪接內(nèi)含子環(huán)狀化

mRNA療法抗病毒機制會大大降低了mRNA的線性半衰期和翻譯效率，可能導致不良影響。環(huán)狀RNA（circRNA）是提高mRNA穩(wěn)定性的有效策略。

作者使用內(nèi)含子-外顯子（PIE）剪接策略構建環(huán)狀RNA。具體方法在于：利用T4噬菌體胸苷酸合成酶基因的I型內(nèi)含子將其與中間斷開，將內(nèi)含子2和內(nèi)含子1順序連接。然后將HRV2 IRES、GSDMDc .825 T>A/c.884 A>G ORF、eGFP ORF和F1LCT依次插入到內(nèi)含子之間。用IVT合成前體RNA，然后加入Mg2+和GTP進行催化環(huán)化（圖5a）。然而，PIE環(huán)化策略未能產(chǎn)生環(huán)化產(chǎn)物（圖5b）。

為了提高剪接效率，作者在線性RNA的5‘和3’端添加了互補的配對同源臂序列，使剪接位點在空間上更接近（圖5c，d）。為了確保剪接核酶的折疊不受高度結構化的HRV2 IRESs的影響，在3‘PIE剪接內(nèi)含子和HRV2 IRESs序列之間添加了一個間隔序列，使HRV2 IRES和PIE的剪接位點能夠獨立折疊成二級結構（圖5c，d）。同源臂和間隔區(qū)將前體RNA環(huán)化效率提高到90%以上,且環(huán)化產(chǎn)物耐受RNase R切割（圖5e）。RNase H質(zhì)檢環(huán)狀RNA呈現(xiàn)單一條帶，而前體RNA產(chǎn)生兩條條帶（圖5f）。此外，Sanger測序結果證實，該產(chǎn)物為一個完整的環(huán)狀RNA（圖5g）。綜上數(shù)據(jù)表明，GSDMDENG環(huán)狀RNA成功體外制備。

GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs消融腫瘤和呈遞抗原

HRV2 IRES-GSDMDENG-F1LCT IVT 環(huán)狀RNA-LNPs (GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs)在體內(nèi)經(jīng)過實驗顯示具有良好的安全性（圖6a-c）。在腫瘤小鼠模型中，GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs可消融各種腺癌，并抑制膠質(zhì)瘤和血液瘤生長（圖6d）；其機制在于，GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs驅(qū)動EIF4G2+ /PTBP1+腫瘤中GSDMD的表達（圖6e，f），并誘導腫瘤線粒體吞噬和腫瘤抗原呈遞，參與腫瘤消融。

線粒體吞噬對于內(nèi)溶酶體呈遞線粒體抗原至關重要。為了確認GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs誘導的線粒體吞噬是否能觸發(fā)適應性抗腫瘤免疫，作者使用慢病毒構建了AsPCs-mtOVA-msCherry穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞（可編碼線粒體定位的OVA和mCherry熒光），經(jīng)過實驗證實了GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs誘導的線粒體吞噬可以觸發(fā)適應性抗腫瘤免疫。

GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs預防KRASG12D腺癌

大約30%的人類腫瘤存在RAS基因突變，其中KRAS是最常見的突變成員?；蚍治鲲@示，在彌漫性大b細胞淋巴瘤（DLBC）、胰腺腺癌（PAAD）、結腸腺癌（COAD）、LUAD和多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）中，KRAS與EIF4G2/PTBP1的高表達呈正相關（圖7a，b）。KRAS經(jīng)常在G12處突變，尤其是在手術切除的PAAD、COAD和LUAD癌組織中，特別是KRASG12D突變（圖7c，d）。作者亦發(fā)現(xiàn)，在KRASG12D突變小鼠的胰腺、肺和結腸中，EIF4G2和PTBP1的表達表現(xiàn)出年齡依賴性的趨勢（圖7e），這可能是KRAS異常激活Raf-MEK-MAPK信號通路有關[3]。因為有結果顯示，CH51226766（Raf-MEK-MAPK信號抑制劑）減弱KRASG12D小鼠中EIF4G2和PTBP1的表達（圖7e）。研究表明，激活Raf-MEK-MAPK信號通路有利于HRV2 IRES的啟動，使HRV2 IRES驅(qū)動的GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs成為腫瘤發(fā)生（KRAS突變驅(qū)動）的潛在預防性治療方法。

除此之外，GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNPs也被證實能夠動員抗腫瘤免疫來保護KRASG12D突變誘導的腺癌發(fā)生，比如降低腫瘤聯(lián)合發(fā)生率，提高機體生存率，激活樹突狀細胞和提高細胞毒性T細胞免疫。

小結

作者通過多種設計和傳遞策略，設計了一個獨特的環(huán)狀RNA——GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNP，它具有腫瘤特異性表達和條件性激活的雙重特性。HRV2-IRES結構確保了其在KRAS突變驅(qū)動EIF4G2/PTBP1激活的癌癥細胞中的翻譯起始，而雙突變氨基酸位點和改造C末端信號肽使其具備定位和激活線粒體。環(huán)化策略和LNP包封增強其在體內(nèi)的表達和遞送效率，以及減弱免疫。GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNP可有效消除腫瘤小鼠模型的腫瘤負擔，間接賦予KRAS突變小鼠的抗腫瘤免疫。這些綜合策略為使用GSDMDENG 環(huán)狀RNA-LNP治療和預防KRAS突變誘導的泛腺癌提供了巨大的前景；也為環(huán)狀RNA替代mRNA靶向腫瘤藥物和疫苗再次奠定了研究基礎。

參考文獻：

[1] Ding, J. et al. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family. Nature 535, 111–116 (2016).

[2] Taylor, A. B. et al. Crystal structures of mitochondrial processing peptidase reveal the mode for specific cleavage of import signal sequences. Structure. 9, 615–625 (2001).

[3] Yan, L. et al. Targeting glucose metabolism sensitizes pancreatic cancer to MEK inhibition. Cancer Res. 81, 4054–4065 (2021).

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s43018-023-00650-8