一、流式細(xì)胞數(shù)基本概念：

FCM：流動細(xì)胞的度量

特點(diǎn)：

1、在流動狀態(tài)下，同時檢測單個細(xì)胞的特性

2、快速

3、特異、靈敏

4、多參數(shù)同時分析

流式檢測的種類

樣本：各種細(xì)胞、微生物、人工合成微球等、血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液

樣本制備：單細(xì)胞懸液（天然狀態(tài)：外周血、機(jī)械研磨/消化：實(shí)體組織）；細(xì)胞濃度：5*105-1*107/ml，體積為0.5-1ml，經(jīng)過300目篩網(wǎng)過濾，防止細(xì)胞樣本有結(jié)塊

流式細(xì)胞儀的信息：物理結(jié)構(gòu)，抗原、細(xì)胞因子表達(dá)

二、流式常見應(yīng)用

三、流式細(xì)胞儀組成和工作原理

液流系統(tǒng)：

單細(xì)胞在流動池經(jīng)過激光檢測，樣本進(jìn)入廢液——?dú)馀輹绊?，因此上樣一定避免氣?/p>

光學(xué)系統(tǒng)：

細(xì)胞上結(jié)合熒光染料，經(jīng)過激光激發(fā)，產(chǎn)生光學(xué)參數(shù)。分別為散射光信號和熒光信號

散射光信號：

檢測細(xì)胞相對大小，而不是具體大小

檢測細(xì)胞相對顆粒度，即細(xì)胞的復(fù)雜程度，例如細(xì)胞器的多少，細(xì)胞表面粗糙度

例子：

左側(cè)：人外周全血紅細(xì)胞，經(jīng)過紅細(xì)胞裂解后，上機(jī)檢測得到的圖，淋巴細(xì)胞體積最小，復(fù)雜程度最低。左下角黑色小點(diǎn)，是樣本中的雜質(zhì)，或者細(xì)胞碎片

熒光信號：

熒光染料與細(xì)胞通過抗原抗體結(jié)合。所以用熒光信號的強(qiáng)弱看細(xì)胞抗原的表達(dá)量

例如：

外周血制備的單細(xì)胞懸液

進(jìn)行CD19 PE和CD3 FICC的染色

上樣，得到雙參數(shù)散點(diǎn)圖

左下角：CD19 PE和CD3FICC表達(dá)量都相對低，所以是一群CD3和CD19雙陰性的細(xì)胞

不同熒光素有獨(dú)特的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜：能夠特異性激發(fā)某種熒光素

發(fā)射光譜：熒光素被激發(fā)后所發(fā)出的一定波長范圍的光線

濾光片：接收發(fā)射光譜

LP500：允許大于500nm的光線通過，小于500nm的光線反射出去

SP500：允許小于500nm的光線

BP500：某一波長范圍內(nèi)的光線，如BP500/50，即500+-25的范圍

電子系統(tǒng)：光信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號

四、流式圖分析

1、流式圖選?。褐狈綀D，二維點(diǎn)圖，等高線圖

直方圖：縱軸是細(xì)胞數(shù)量，是單參數(shù)分析

左側(cè)峰，是CD3陰性的細(xì)胞；右側(cè)峰是陽性細(xì)胞

二維點(diǎn)圖：雙參數(shù)分析

Treg細(xì)胞應(yīng)該在右下方這群，但是與其他細(xì)胞沒有明顯界限，就用到了等高線圖

當(dāng)細(xì)胞群不能區(qū)分時，可以用等高線試一試，看某個細(xì)胞群能否形成一個群體，等高線越密集，說明此處細(xì)胞密度相對較高

2、流式對照：陰性對照，單陽性對照

2.1陰性對照：空白對照，同型對照

Y字狀結(jié)構(gòu)，是抗體的結(jié)構(gòu)圖

細(xì)胞在熒光染料進(jìn)行染色，會出現(xiàn)特異性和非特異性結(jié)合（不需要抗原就可以結(jié)合），出現(xiàn)兩種熒光

2.2陰性對照如何選擇同型對照抗體

2.3陰性對照作用

（1）設(shè)定實(shí)驗(yàn)檢測條件

調(diào)整散射光電壓：即FSC和SSC的電壓，看到細(xì)胞群體；

調(diào)節(jié)熒光通道電壓：確定陰性細(xì)胞位置，陰性對照的信號應(yīng)該落在左下角

設(shè)定閾值：確定觀測范圍。就是切除部分雜質(zhì)

2.2單陽性對照——熒光素發(fā)射光譜重疊

480nm激光器激發(fā)后，F(xiàn)ITC發(fā)射光譜為綠色峰；PE發(fā)射光譜在黃色區(qū)域；綠色和黃色透明方塊是儀器配置的濾光片的檢測范圍

PE和FITC的濾光片都有重疊信號，即圖中畫出的紅色標(biāo)記，就是需要去除的信號

例子：FITC單染管，出現(xiàn)了PE信號

在PE中減去FITC信號

（1）如何設(shè)置單陽性對照

1號管：陰性對照管/同型對照管，F(xiàn)ITC和PE的同型對照抗體

2號管：FITC的抗體和PE的同型對照抗體

3號管

樣本管：加入FITC抗體和PE抗體

（2）補(bǔ)償模型：雙染舉例

具體講解：

正確補(bǔ)償：圖是橫平豎直的

肉眼觀察圖片不一定準(zhǔn)確，需要數(shù)據(jù)統(tǒng)計表看具體數(shù)值——Medin

圖中正確補(bǔ)償中，陰性群是64，陽性是69，相近

補(bǔ)償不足：陽性群太高，需要降到61左右

總結(jié)