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乳腺癌術(shù)后治療：可注射雙層凝膠實(shí)現(xiàn)索拉非尼和抗CD47抗體的貫序釋放

2021-11-11 10:41 作者:北科納米 0人讀過(guò) | 我要投稿

乳腺癌細(xì)胞的高侵襲性以及手術(shù)切除后的高度免疫抑制微環(huán)境導(dǎo)致化療、放療以及免疫療法等治療方法效果受限。由于巨噬細(xì)胞具有可塑性，將促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)通過(guò)“再教育”為具有抗腫瘤活性的M1型，有望逆轉(zhuǎn)術(shù)后免疫抑制微環(huán)境。此外，抗CD47抗體(aCD47)通過(guò)阻斷CD47與信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的相互作用，能夠激活吞噬細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)抗腫瘤療效。因此，本研究提出假設(shè)：在CD47免疫阻斷治療之前，優(yōu)先對(duì)腫瘤術(shù)后的TAMs進(jìn)行再“再教育”，有望建立一個(gè)整體免疫有利的微環(huán)境，以提高抗腫瘤效果。

Time-Programmed Delivery of Sorafenib and Anti-CD47 Antibody via a Double-Layer-Gel Matrix for Postsurgical Treatment of Breast Cancer

Liping Huang, Yiyi Zhang, Yanan Li, Fanling Meng, Hongyu Li, Huimin Zhang, Jiasheng Tu, Chunmeng Sun*, Liang Luo*

Nano-Micro Letters (2021)13: 141

https://doi.org/10.1007/s40820-021-00647-x

本文亮點(diǎn)

1. 開發(fā)了一種新型可注射雙層凝膠；

2. 分層結(jié)構(gòu)的雙層脂質(zhì)凝膠可實(shí)現(xiàn)藥物時(shí)間貫序釋放；

3. 證實(shí)了優(yōu)先釋放適宜劑量的索拉菲尼能夠?qū)δ[瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞進(jìn)行“再教育”并增強(qiáng)抗CD47抗體的效果。

內(nèi)容簡(jiǎn)介

華中科技大學(xué)羅亮教授與中國(guó)藥科大學(xué)孫春萌副教授聯(lián)合團(tuán)隊(duì)在這項(xiàng)研究中構(gòu)建了由不同比例的大豆卵磷脂/二油酸甘油酯組成的可注射雙層凝膠，以實(shí)現(xiàn)貫序釋藥、逆轉(zhuǎn)免疫微環(huán)境，并且結(jié)合免疫阻斷療法，從而更好地防止乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。雙層凝膠的外層具有熱響應(yīng)性，并負(fù)載吸附有索拉菲尼(SRF)的氧化石墨烯(GO)納米粒子。GO在人工控制的近紅外照射下產(chǎn)生較為溫和的熱量，首先刺激SRF的釋放，對(duì)TAMs進(jìn)行再“再教育”，促進(jìn)免疫原性微環(huán)境的形成。內(nèi)層凝膠負(fù)載aCD47，能夠長(zhǎng)時(shí)間維持凝膠狀態(tài)，使得aCD47持續(xù)釋放，阻斷CD47與SIRPα通路，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的抗腫瘤效果。體內(nèi)4T1荷瘤小鼠模型研究表明，基于雙層凝膠的貫序釋藥策略通過(guò)逆轉(zhuǎn)局部免疫抑制，協(xié)同阻斷CD47介導(dǎo)的免疫逃逸，能夠增強(qiáng)全身免疫反應(yīng)，有效地防止腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。

圖文導(dǎo)讀

I 雙層凝膠的設(shè)計(jì)與表征

分別制備包封SRF@GO(SG)的外層凝膠前體和包封aCD47的內(nèi)層凝膠前體，并分別裝入雙筒注射器中。如圖1所示，依次注射后，可形成界限分明的雙層凝膠。體內(nèi)外光熱性能考察結(jié)果顯示，雙層凝膠光熱性能良好，升溫隨功率可調(diào)且2分鐘之內(nèi)便可達(dá)到所需溫度。體外實(shí)驗(yàn)中外層包載SG，內(nèi)層使用IgG模擬aCD47。

結(jié)果均表明能夠?qū)崿F(xiàn)良好的貫序釋藥，即外層通過(guò)光控釋藥優(yōu)先釋放，內(nèi)層則長(zhǎng)效緩釋。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用Ce6模擬SRF，AFIgG模擬aCD47，同樣證明可實(shí)現(xiàn)貫序釋藥。

圖1. (a) 使用雙筒注射器形成雙層凝膠示意圖；(b, c) 4T1-luc荷瘤小鼠術(shù)后經(jīng)PBS、Blank DLG、SG溶液和LG50/50+SG@LG35/65治療后施加808 nm激光照射20分鐘內(nèi)溫度變化情況(n=3)；(d) 體外光控釋放SRF和長(zhǎng)效緩釋IgG的累計(jì)釋放量(n=3)；(e, f) 小鼠體內(nèi)熒光成像Ce6剩余情況(n=3)；(g, h) 小鼠體內(nèi)熒光成像AFIgG剩余情況(n=3)。

IISRF的最優(yōu)釋放方案篩選

SRF對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)和抗腫瘤療效具有劑量依賴性，因此篩選最適合本研究的索拉菲尼釋放方案對(duì)于免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)和腫瘤治療至關(guān)重要。如圖2所示，本研究控制不同組別藥物劑量一致，即aCD47為70 μg/只，SRF為50 μg/只。通過(guò)改變內(nèi)外層凝膠體積比、光照時(shí)間與光照頻率，從而改變內(nèi)外層凝膠的釋放速率，以篩選調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境(Tumor microenvironment, TME)的最優(yōu)方案。最終確定內(nèi)外層凝膠各50 μL，于第0天、2天、4天和6天每次光照20分鐘為最優(yōu)治療方案。

圖2. (a) 不同治療策略篩選示意圖；(b, c) 引流淋巴結(jié)中DC細(xì)胞浸潤(rùn)情況(n=3)；(d, e) 引流淋巴結(jié)中CD4?和CD8? T細(xì)胞浸潤(rùn)情況(n=3)；(f-h) 腫瘤中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況(n=3)；(i) 各組第8天腫瘤微血管免疫熒光染色。(比例尺：100 μm)。

III體內(nèi)抗腫瘤療效

通過(guò)構(gòu)建不完全切除的4T1-luc荷瘤小鼠模型，即待腫瘤生長(zhǎng)至約300 mm3時(shí)，切除約90%的腫瘤，留下大約10%的腫瘤，模擬術(shù)后未完全切除的腫瘤模型。

對(duì)小鼠按照以下6組方案進(jìn)行治療：PBS不加光組(PBS組，G1)、雙層未載藥凝膠不加光組(LG35/65+LG50/50組，G2)、aCD47與SG混合溶液加光組(G3)、外層凝膠未載藥內(nèi)層載aCD47不加光組(LG35/65+aCD47@LG50/50組，G4)、外層凝膠載SG內(nèi)層未載藥加光組(SG@LG35/65+LG50/50組，G5)、外層凝膠載SG內(nèi)層載aCD47不加光組(SG@LG35/65+aCD47@LG50/50-L組，G6)與外層凝膠載SG內(nèi)層載aCD47加光組(SG@LG35/65+aCD47@LG50/50+L組，G7)。其中，內(nèi)外層凝膠的體積均為50 μL，aCD47劑量均為70 μg/只，索拉菲尼的劑量均為50 μg/只。加光組小鼠分別于0、2、4 、6d施加808 nm激光光照，每次20 min。使用熱成像儀持續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠腫瘤部位溫度，手動(dòng)調(diào)節(jié)激光器功率，使照射部位溫度維持在42~45℃，并利用4T1-luc腫瘤細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。如圖3所示，在23天的治療期間，G7組，即SG@LG35/65+aCD47@LG50/50+L組腫瘤熒光明顯弱于其他各組。第23天時(shí)小鼠的腫瘤體積和質(zhì)量也明顯低于其他各組，血管的CD31和α-SMA信號(hào)較其他各組弱此外，G7組小鼠的生存期也得到明顯延長(zhǎng)。這表明SG@LG35/65+aCD47@LG50/50+L的策略能夠有效抑制腫瘤復(fù)發(fā)及腫瘤血管新生。

圖3. (a) 藥效及免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；(b) 4T1-luc荷瘤小鼠術(shù)后經(jīng)各組治療后的腫瘤熒光成像；(c) 4T1-luc荷瘤小鼠術(shù)后經(jīng)各組治療后腫瘤生長(zhǎng)曲線(n=5)；(d) 治療后第23天每組代表性小鼠腫瘤質(zhì)量；(e) 小鼠生存曲線(n=8)；(f)各組第8天腫瘤微血管免疫熒光染色。(比例尺：100 μm)。

IV 免疫應(yīng)答效果考察

基于上述對(duì)于腫瘤復(fù)發(fā)的良好抑制效果，本文于術(shù)后第8天對(duì)淋巴結(jié)和腫瘤部位的其他免疫細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步對(duì)于貫序釋放索拉菲尼和aCD47的雙層凝膠免疫應(yīng)答效果進(jìn)行考察。如圖4所示，G7組的M1型巨噬細(xì)胞為19.4%，而G1組僅為8.2%；G7組的M2型巨噬細(xì)胞為8%，而G1組高達(dá)為21%，這表明索拉菲尼能夠?qū)奘杉?xì)胞進(jìn)行有效地“再教育”。對(duì)于血清中細(xì)胞因子的水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，G7組治療后，包括IFN-γ、TNF-α和IL-2在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子水平上調(diào)，這幾種細(xì)胞因子可由M1型巨噬細(xì)胞分泌，并能夠輔助T細(xì)胞介導(dǎo)的抑瘤免疫作用。相反，與其他組小鼠相比，G7組由M2型巨噬細(xì)胞分泌的免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10水平顯著下降。

本文進(jìn)一步對(duì)其他免疫細(xì)胞水平進(jìn)行考察，如圖5所示，G7組小鼠淋巴結(jié)中成熟的DC細(xì)胞最多，約為20.8%，淋巴結(jié)中的CD8? T細(xì)胞和CD4? T細(xì)胞浸潤(rùn)最多。同時(shí)，與G1組相比，負(fù)載aCD47的G3和G4組的小鼠成熟的DC細(xì)胞和CD8? T細(xì)胞的水平也明顯升高，這表明aCD47能夠有效激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。與淋巴結(jié)中結(jié)果相似，G7組的腫瘤組織中CD8? T細(xì)胞和CD4? T細(xì)胞浸潤(rùn)最多，而具有抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫效果的Treg細(xì)胞水平最低。這說(shuō)明該種策略能夠有效地逆轉(zhuǎn)術(shù)后免疫抑制微環(huán)境，塑造腫瘤部位的免疫原性微環(huán)境。

圖4. (a, b) M1型、M2型巨噬細(xì)胞的流式分析圖；(c) M1型巨噬細(xì)胞的比例統(tǒng)計(jì)；(d) M2型巨噬細(xì)胞的水平統(tǒng)計(jì)；(e) M1型、M2型巨噬細(xì)胞的比值；(f) 各組小鼠血清中IFN-γ的水平統(tǒng)計(jì)；(g) 各組小鼠血清中TNF-α的水平統(tǒng)計(jì)；(h) 各組小鼠血清中IL-2的水平統(tǒng)計(jì)。

圖5. (a) DC細(xì)胞的流式分析圖；(b) 引流淋巴結(jié)中CD4?和CD8? T細(xì)胞的流式分析圖；(c) Treg細(xì)胞的流式分析圖；(d) DC細(xì)胞的水平統(tǒng)計(jì)；(e) CD8? T細(xì)胞的水平統(tǒng)計(jì)；(f) Treg細(xì)胞的水平統(tǒng)計(jì)。

V 長(zhǎng)期免疫記憶效果考察

最后，本研究使用更具侵略性的全身擴(kuò)散腫瘤模型對(duì)貫序釋放索拉菲尼和aCD47的雙層凝膠能否誘導(dǎo)全身免疫記憶進(jìn)行探究。如圖6所示，G7組的肺轉(zhuǎn)移情況明顯低于其他各組。對(duì)各組肺結(jié)節(jié)數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果同樣顯示，G7組的肺結(jié)節(jié)數(shù)目明顯低于其他組，甚至比PBS組低16倍。這說(shuō)明本研究的程序性釋放索拉菲尼和aCD47，使用光熱聯(lián)合免疫阻斷療法的策略能夠有效激發(fā)機(jī)體的全身免疫應(yīng)答，有效地組織腫瘤的自發(fā)性轉(zhuǎn)移。本研究進(jìn)一步對(duì)該種策略產(chǎn)生的免疫記憶效果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。效應(yīng)記憶T細(xì)胞(Effector memory T cells, TEM)可被立即激活發(fā)揮效應(yīng)，而中央記憶T細(xì)胞(Central memory T cells, TCM)則需要較長(zhǎng)的時(shí)間產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在注射4T1-luc細(xì)胞的次日，G7組小鼠的淋巴結(jié)中TEM的比例最高，并且G7組的TCM與除了G3組之外的其余各組對(duì)比數(shù)量也有所增加。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，基于程序性釋放索拉菲尼和aCD47、光熱療法聯(lián)合免疫阻斷療法的策略有利于建立長(zhǎng)期的抗腫瘤免疫記憶。

圖6. (a) 免疫記憶效果及抑制肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；(b, c) 各組小鼠術(shù)后51天肺轉(zhuǎn)移情況；(d) 各組小鼠術(shù)后51天肺結(jié)節(jié)數(shù)目統(tǒng)計(jì)(n=4)；(e) 靜脈注射4T1-luc細(xì)胞次日小鼠淋巴結(jié)中TEM細(xì)胞水平；(f) 靜脈注射4T1-luc細(xì)胞次日小鼠淋巴結(jié)中TCM細(xì)胞水平。

作者簡(jiǎn)介

羅亮

本文通訊作者

華中科技大學(xué) 教授▍主要研究領(lǐng)域

新功能材料的合成及在醫(yī)學(xué)影像、生物檢測(cè)、藥物遞送等方面的應(yīng)用研究。

▍主要研究成果

自2018年來(lái)以通訊作者在Journal of the American Chemical Society、Nature Communications、Advanced Materials、Advanced Functional Materials等期刊已發(fā)表近30篇高水平論文，獲批中國(guó)發(fā)明專利10余項(xiàng)。曾任美國(guó)康涅狄格州美中醫(yī)藥開發(fā)協(xié)會(huì)會(huì)長(zhǎng)，回國(guó)后作為課題負(fù)責(zé)人承擔(dān)國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“納米專項(xiàng)”、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目等，先后入選國(guó)務(wù)院僑務(wù)辦公室重點(diǎn)華人華僑創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)、武漢市光谷3551創(chuàng)新人才計(jì)劃等，并擔(dān)任中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)納米腫瘤學(xué)青年專業(yè)委員會(huì)副主任委員、中國(guó)化學(xué)會(huì)分子聚集發(fā)光專業(yè)委員會(huì)委員、中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)材料生物學(xué)與智能診療技術(shù)分會(huì)副秘書長(zhǎng)。

▍Email: liangluo@hust.edu.cn

▍課題組主頁(yè)

liangluogroup.wqdian.cn/

孫春萌

本文通訊作者

中國(guó)藥科大學(xué) 副教授▍主要研究領(lǐng)域

藥物新制劑和制劑新技術(shù)、智能納米藥物遞送系統(tǒng)、腫瘤免疫治療、靶向性細(xì)胞穿膜肽的設(shè)計(jì)、仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)、藥用輔料相關(guān)研究等。

▍主要研究成果

已發(fā)表論文40余篇，其中以第一作者和通訊作者在Nature Communications, Advance Functional Materials, Journal of Controlled Release等國(guó)際權(quán)威期刊發(fā)表SCI論文20余篇。以第一發(fā)明人申請(qǐng)專利2項(xiàng)。作為主要完成人，獲2016年江蘇省教育科學(xué)研究成果獎(jiǎng)科技進(jìn)步獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)。2017年，接受《江蘇科技報(bào)》“人物”欄目專訪。2017-2018年，參與國(guó)家藥品審評(píng)中心《藥物注射劑研發(fā)技術(shù)指導(dǎo)意見》、《已上市化學(xué)仿制藥(注射劑)一致性評(píng)價(jià)技術(shù)要求》等文件起草工作。為2020年版《中國(guó)藥典》制修訂指導(dǎo)原則和通用檢查法5項(xiàng)。另參編國(guó)家藥典委員會(huì)專著《各國(guó)藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比手冊(cè)》、國(guó)家高等醫(yī)藥院校藥學(xué)類雙語(yǔ)教材《藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)與指導(dǎo)》等。

▍Email: suncmpharm@cpu.edu.cn