基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學分析是發(fā)現(xiàn)新的疾病生物標志物的有力手段。然而，研究設計的某些關(guān)鍵步驟，如隊列選擇、統(tǒng)計能力評估、樣本盲化和隨機化以及樣本和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，往往在實驗設計和執(zhí)行過程中被忽視或不被重視。本教程討論了設計和實現(xiàn)基于液相色譜-質(zhì)譜的生物標志物發(fā)現(xiàn)研究的重要步驟，并描述了這種研究的每個步驟的基本原理、考慮因素和可能的失敗，包括實驗設計、樣本收集和處理以及數(shù)據(jù)收集。

生物標志物發(fā)展的階段

生物標志物的發(fā)現(xiàn)通常分為三個不同的階段:發(fā)現(xiàn)、驗證和確認。

在發(fā)現(xiàn)階段，少量樣本被提交進行深入的蛋白質(zhì)組學分析，其中數(shù)千個蛋白質(zhì)被測量以確定生物標志物候選。通常，更大的樣本群會在隨后的階段進行分析，從而增加統(tǒng)計能力。生物標志物候選人也根據(jù)其表現(xiàn)在每個發(fā)育階段向下選擇，以準確預測疾病或狀況。在某些情況下，作為生物標志物測試的是組合蛋白而不是單個蛋白。在驗證階段，候選生物標志物進行額外的蛋白質(zhì)組學分析，以驗證它們在發(fā)現(xiàn)階段相同或類似樣本中的身份和表達。一些最有希望的候選藥物將在驗證階段進行測試，以確定其臨床使用的性能。

發(fā)現(xiàn)階段的注意事項

樣本選擇時考慮多種變量如生理因素的影響，包括年齡、性別、體重指數(shù)、禁食狀態(tài)、采集時間（晝夜節(jié)律或晝夜影響）、月經(jīng)周期階段、運動狀態(tài)、采集季節(jié)、醫(yī)學合并癥和干擾藥物等。樣本收集前需制定標準收樣SOP，填寫規(guī)范詳細信息問卷，確定使用的試劑耗材批次類型，如采血管類型，蛋白酶抑制劑，液氮等，避免反復凍融，所有樣本采集環(huán)境一致。前處理后可根據(jù)樣品的復雜性，進行高豐度蛋白的去除和增加上機餾分，以增加檢測低豐度蛋白質(zhì)的概率。高豐度蛋白樣本例如血漿和血清樣本。這類樣本蛋白中廣泛存在的蛋白種類有10000多種，大多數(shù)都是含量非常低的低豐度蛋白。然而往往低豐度蛋白行使著重要的“信使”功能：通知細胞開關(guān)信號傳導通路，在細胞死亡和疾病發(fā)育中扮演著核心角色。因此對低豐度蛋白的識別非常重要。青蓮也一直致力于研究提高血液樣本鑒定覆蓋率的方法，經(jīng)過多年的摸索和反復的實驗驗證，青蓮即將推出一種特殊材料，能夠顯著提升血液樣本鑒定數(shù)量，敬請期待！

下面列出了工作流每一步的主要考慮點。注意，這里展示了一個血漿分析的示例，但是其他樣本類型在工作流中可能有一些額外的或更少的步驟。

驗證階段的注意事項

驗證階段的重點是通過定量測量確認疾病組和對照組之間目標肽的豐度存在顯著差異。穩(wěn)定同位素標記的合成肽通常被到關(guān)注的樣品之中，達到基于靶向質(zhì)譜來對目標肽進行可靠的檢測和定量。

靶向標志物篩選條件

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