《發(fā)酵工程》第二章 發(fā)酵工程菌種1、發(fā)酵工程菌：發(fā)酵工業(yè)的微生物種類很多，可分為兩二類，即可培養(yǎng)微生物和未培養(yǎng)微生物。其中，可培養(yǎng)微生物包括四大類：1）細菌：單細胞原核微生物，分布最廣、數(shù)量最多，工業(yè)上常用的有枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等，用于各種酶制劑、有機酸、氨基酸等； 2）放線菌：單細胞原核，因菌落呈放線狀而得名，最大的經(jīng)濟價值在于能產(chǎn)生多種抗生素，常用的放線菌主要來自鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡菌屬，如鏈霉素、紅霉素、金霉素； 3）酵母菌：一類單細胞，兼性厭氧，出芽生殖真核微生物，啤酒酵母、假絲酵母、類酵母用于生產(chǎn)啤酒、制造面包、生產(chǎn)脂肪酶和可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白； 4）霉菌：發(fā)霉的真菌，根霉、毛霉、紅曲霉、青霉，它們廣泛用于生產(chǎn)酶制劑等。2、發(fā)酵工程菌種的分離篩選：發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求：1）能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上生長，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易回收；2）生長快，發(fā)酵周期短；3)培養(yǎng)條件易于控制；4）抗噬菌體和雜菌污染能力強；5）菌種不易變異退化；6）對放大設(shè)備的適應(yīng)性強；7）菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。 ? ?菌種的獲得途徑：1）從菌種保存機構(gòu)直接購買（CCCCM中、ATCC美）；2）從自然屆分離篩選；3）從發(fā)酵水平高的批號中重新進行分離篩選。 ? ? 菌種的分離篩選過程：樣品的采集（土壤、海洋、空氣、極端環(huán)境微生物、動植物中，總原則是來源越廣泛，獲得新菌種的可能性越大）------材料的預處理（熱處理、膜過濾、離心法、添加幾丁質(zhì)分離放線菌）--------富集培養(yǎng)（控制營養(yǎng)成分和條件篩選目的菌）------菌種分離（平板劃線分離法、涂布分離法）見P18-------菌種的初篩和復篩----菌種鑒定，確定菌種類型。3、菌種的代謝：1）初級代謝產(chǎn)物：把微生物產(chǎn)生的對自身生長和繁殖必需的物質(zhì)稱為初級代謝產(chǎn)物。2）次級代謝產(chǎn)物：由生物體合成，但對其自身的生長、繁殖和發(fā)育并沒有影響的一類物質(zhì)，如抗生素、生物堿、色素、毒素等。 ? ? 代謝控制機制包括酶合成的調(diào)節(jié)（誘導和阻遏）和酶活性的調(diào)節(jié)。4、菌種的選育方法：自然選育（利用菌種的自然突變而進行菌種的篩選）、誘變育種（理論基礎(chǔ)是基因突變，誘變和篩選不斷重復）、細胞工程育種、雜交育種（將兩個基因型不同的菌株接合）、原生質(zhì)體融合（去除細胞壁后選PEG作為助融劑）、基因工程育種、蛋白質(zhì)工程育種、組合生物合成育種（利用重組工程酶對一些藥物和化合物直接進行衍生化）、反向生物工程育種。

5、以抗生素為例簡述篩選菌種的方法和過程：對象確定----采集樣本----富集培養(yǎng)（投其所好、取其所抗之原則）-----初篩-----復篩----較優(yōu)菌株斜面------性能測定-----菌種保藏

6、接種齡：種子罐中培養(yǎng)的菌體從開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間；

?接種量：移入的種子懸浮液體積和接種后培養(yǎng)液體的體積的比例。

第三章 ?培養(yǎng)基

1、培養(yǎng)基的分類：1）按純度分：合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基； 2）按狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基；3）按用途分：孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基；

2、選擇性培養(yǎng)基：是指根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某種化學、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。其功能是使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌，從而提高改菌的篩選效率。

3、培養(yǎng)基的成分：

1）碳源：常用的碳源有糖類（葡萄糖、糖蜜、淀粉糊）、油脂（豆油、菜油、魚油）、有機酸（乳酸、檸檬酸、乙酸）和烴醇（正烷烴）等。

2）氮源：有機氮源（花生餅粉、黃豆餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉）、無機氮源（NH4Cl、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨、氨水）

3）無機鹽及微量元素：P、S、Mg、Fe、K、Na、Cu、Zn、Mn、Gu等。

4）水：

5）生長因子（氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等）、前體、產(chǎn)物促進劑和抑制劑（在次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵過程中，往往抑制某一代謝途徑就會使另一代謝途徑活躍）

● 生理酸性物質(zhì)：經(jīng)微生物生理作用后能形成酸性物質(zhì)的無機氮源。如硫酸銨；如菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無機氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。

● 前體：能被微生物直接利用，以構(gòu)成次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的一部分，而其本身結(jié)構(gòu)沒有大的變化，這種物質(zhì)稱為前體，如玉米漿中的苯乙胺。

4、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制條件：1）都必須含有合成細胞組成所必需的原料；2）滿足一般生化反應(yīng)的基本條件；3）一定的pH條件等；4)工業(yè)生產(chǎn)上選擇的培養(yǎng)基俗稱發(fā)酵培養(yǎng)基，還應(yīng)包括能夠促進微生物合成產(chǎn)物所必需的成分。

第四章 滅菌

1、滅菌：用物理或化學的方法殺滅或去除物料或設(shè)備中所有生命物質(zhì)的過程。包括化學滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌（原理是高溫下微生物細胞的蛋白變性而死亡）和過濾除菌。

2、對數(shù)殘留定律：濕熱滅菌時，微生物死亡速率與殘留菌數(shù)成正比叫對數(shù)殘留定律。

-dN/dt=K*N N—殘存的活菌數(shù)；t—滅菌時間（s）；K—滅菌速度常數(shù)（1/s）與微生物種類和加熱溫度有關(guān)；dN/dt-活菌數(shù)瞬時變化速率，即死亡速率。

● 為什么高溫滅菌優(yōu)于其他滅菌方法？

從理論研究和生產(chǎn)實踐都證明，在滅菌過程中，同時會發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩個過程，微生物死亡速率的提高超過培養(yǎng)基成分破壞速率的增加，要減少營養(yǎng)成分的破壞，可升高溫度滅菌。因此，對于同一滅菌效果，選擇較高的溫度、較短的時間，這樣既可達到需要的滅菌程度，同時又可減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失。

3、分批滅菌：是將配制好的培養(yǎng)基放在發(fā)酵罐或其他容器中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所有設(shè)備一起滅菌的操作過程。包括升溫、保溫、降溫三個階段。滅菌主要是在保溫過程中實現(xiàn)，在升溫階段后期，也有一定的滅菌作用。

4、連續(xù)滅菌：將配制好的培養(yǎng)基在通入發(fā)酵罐時進行加熱、保溫、降溫的滅菌過程，也稱之為連消。 其流程為：配料—預熱（預熱桶作用是定容和預熱，目的是使培養(yǎng)基在后續(xù)加熱過程中能快速地升溫到指定的滅菌溫度）---加熱（用連消泵打入加熱器，使培養(yǎng)基與蒸汽混合并迅速達到滅菌溫度，加熱器有塔式和噴射式兩種）----保溫（維持滅菌溫度一段時間，是殺滅微生物的主要過程，維持罐和管式維持器）----降溫（迅速降溫）

5、空氣除菌：好氧性微生物需要空氣，為保證純種培養(yǎng)，需要空氣滅菌。方法有：輻射殺菌（高能陰極射線、X、β、γ射線、紫外線能破壞蛋白質(zhì)活性而殺菌，紫外線用的最多）

化學、蒸汽滅菌、靜電除菌（利用靜電引力吸附帶電粒子）、熱殺菌、過濾除菌(介質(zhì)過濾是采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣所含的微生物，常用的介質(zhì)有棉花、活性炭和玻璃纖維、礦渣、金屬絲纖維、合成纖維等。 棉花要選用未經(jīng)脫脂的，這樣壓緊后仍有彈性，纖維長度要適中，填充率為8.5%-10%。

編輯切換為居中

● 空氣過濾除菌包括絕對過濾和深層過濾：1）絕對過濾是介質(zhì)孔隙小于被攔截的微生物大小，如用聚四氟乙烯或纖維素酯材料制成的微孔濾膜，孔徑0.22um。 ?

2）深層過濾是指介質(zhì)孔隙大于被攔截的微生物大小，但介質(zhì)有一定的厚度，機理是靜電、擴散、慣性及攔截作用。如棉花過濾器、石棉濾板、金屬燒結(jié)管等。 深層過濾效率是濾層所濾去的微粒與原來微粒的比值，即穿透濾層微粒與原有微粒的比。

● 對數(shù)穿透定律：空氣通過單位濾層后微粒下降的速度與進入空氣微粒的濃度成正比；進入濾層的微粒數(shù)與穿透濾層的微粒數(shù)之比的對數(shù)是濾層厚度的函數(shù)。

6、空氣的預處理流程：

前置過濾器（可降低過濾器負荷，即多次過濾）---空壓機（提供動力，以克服隨后各設(shè)備的阻力，包括往復式、螺旋桿式、渦輪式）---空氣貯罐----冷卻器----氣液分離器（冷卻后的壓縮空氣，會有來自空壓機的潤滑油，如果冷卻溫度低于露點，空氣中還會有水，除去空氣中的水和油，以保護過濾介質(zhì)）----冷卻器----氣液分離器絲----絲網(wǎng)過濾器----加熱器----總過濾器----分過濾器

7、空氣過濾的機理：1）慣性沖擊滯留機理；2）攔截滯留機理；3）布朗擴散作用機理；

4）重力沉降；5）靜電吸附

第五章 生物反應(yīng)動力及過程分析

1、酶：生物酶分為六大類：氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶。

2、代謝產(chǎn)物形成的動力學模型，gaden根據(jù)產(chǎn)物生產(chǎn)速率和細胞生長速率之間的關(guān)系，將其分成三種類型：

1）相關(guān)模型（伴隨生長的產(chǎn)物形成模型）：指產(chǎn)物的生成與細胞的生長相關(guān)的過程，此時產(chǎn)物通常是基質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的生成與細胞的生長是同步的。（各高峰幾乎同時出現(xiàn)，有平行總量關(guān)系，這些發(fā)酵的產(chǎn)物有菌體本身）

2）部分相關(guān)模型（不完全伴隨生長的產(chǎn)物形成模型）：反應(yīng)產(chǎn)物的生成與細胞生長僅有間接關(guān)系。在細胞生長期內(nèi)，基本無產(chǎn)物生成（菌體生長與細胞生成的兩個主峰分別出現(xiàn)在兩個期，在菌體生長期不合成或很少合成，產(chǎn)物生成期菌體生長率出現(xiàn)微弱回升，有檸檬酸發(fā)酵和氨基酸發(fā)酵等）

3）非相關(guān)模型（不伴隨生長的產(chǎn)物形成模型）：產(chǎn)物的生成與細胞的生長無直接聯(lián)系。它的特點是當細胞處于生長階段時，并無產(chǎn)物積累，而當細胞停止生長后，產(chǎn)物卻大量生成。（菌體生長與產(chǎn)物合成形成不相關(guān)的兩個階段，第一期長菌，在產(chǎn)物合成期無菌體生長的回升現(xiàn)象，產(chǎn)品有抗生素、維生素、色素等次級代謝產(chǎn)物）

編輯

3、Monod方程：在培養(yǎng)基無抑制劑的情況下，細胞的比生長速率與限制性基質(zhì)濃度之間的關(guān)系

編輯切換為居中

● 幾個概念：1、比生產(chǎn)速率μ是菌體繁殖速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比μ=（dx/dt）/x；單位為1/h，其中X--菌體濃度單位為g/L。對數(shù)期為常數(shù)； ?2、基質(zhì)比消耗速率qs是指單位時間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)的量（ds/dt）/x；單位為1/h，其中S—底物濃度單位為g/L； ?3、產(chǎn)物生產(chǎn)比速率qp是指單位時間內(nèi)單位體積發(fā)酵液生產(chǎn)產(chǎn)物的量（dp/dt/dv）。 ?X為菌體濃度，u為比生長速率；4、得率系數(shù)：表示消耗單位營養(yǎng)物所生產(chǎn)的細胞或產(chǎn)物數(shù)量。其包括生長得率系數(shù)和產(chǎn)物得率系數(shù)：1）生長得率系數(shù)Yx/S、Yx/O2、Yx/Kcal分別表示消耗每克營養(yǎng)物、每摩爾氧和每千卡能量所生產(chǎn)的細胞數(shù); 2）產(chǎn)物得率系數(shù)Yp/S、YCO2/S、YATP/S、YCO2/O2表示消耗每克營養(yǎng)物（S）或每摩爾氧（O2）生產(chǎn)的產(chǎn)物（P）或ATP和CO2的克數(shù)。5、分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵：1）分批發(fā)酵：是一種準封閉式系統(tǒng)，是指一次性投料、接種直到發(fā)酵結(jié)束，此過程中發(fā)酵液始終留在發(fā)酵罐內(nèi)，所有液體的流量為零。圖：

說明：1）延遲期：細胞濃度無明顯變化；2）對數(shù)期：細胞濃度隨時間呈指數(shù)生長；3）減速期：細胞的生長速率開始減慢；4）靜止期：細胞濃度不再增加，為最大值；5）衰亡期：細胞開始死亡，細胞生長速率為負值。2）補料分批發(fā)酵：指在分批發(fā)酵過程中補充培養(yǎng)基，而不從發(fā)酵體系中排出發(fā)酵液，使發(fā)酵液體積隨著發(fā)酵時間逐漸增加。 3）連續(xù)發(fā)酵：指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定，使微生物細胞能在近似恒定狀態(tài)下生長的微生物培養(yǎng)方式。 稀釋速率D：等于培養(yǎng)液在罐中平均停留時間的倒數(shù)，在穩(wěn)定狀態(tài)下，細胞的比生長速率等于稀釋速率。 ? D=F/V=u6、單級連續(xù)發(fā)酵：反應(yīng)器中的培養(yǎng)基接種后，通常先進行一段時間的分批培養(yǎng)，待細胞濃度達到一定程度后，以恒定的流量F將新鮮培養(yǎng)基送入培養(yǎng)基，同時用泵將反應(yīng)器中的培養(yǎng)液以同樣的流量抽出，于是反應(yīng)器中的培養(yǎng)液體積V保持不變。7、多級連續(xù)培養(yǎng)：將多個攪拌罐反應(yīng)器串聯(lián)起來，前一反應(yīng)器的出料作為后一反應(yīng)器的進料，即成為多級連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。

第六章 發(fā)酵工業(yè)中氧的供需1、呼吸強度：單位質(zhì)量干菌體在單位時間內(nèi)所吸取的氧量，以Qo2表示。2、攝氧率（好氧速率）：指單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)的耗氧量，以γ表示。3、氧的傳遞過程：1）供氧（空氣中氧---氣膜---氣液界面---液膜---液體主流中） 2）耗氧（液體主流---液膜---菌絲叢---細胞膜---細胞內(nèi)）4、氧的傳遞阻力：1）供氧阻力：① 氧從氣相主體擴散到氣—液界面的阻力；② 通過氣—液界面的阻力；③ 通過細胞外側(cè)的滯流液膜，達到液相主體的阻力；④ 液相主體中的傳遞阻力 ? ? ? ? ? ? 2)秏氧阻力：⑤ 通過細胞或細胞團外的滯流液膜，到達細胞團與液體界面的阻力；⑥ 通過液體與細胞團之間界面的阻力；⑦ 細胞團在細胞與細胞之間的介質(zhì)中的擴散阻力；⑧ 進入細胞的阻力；⑨ 細胞內(nèi)反應(yīng)阻力。注：供氧方面的主要阻力是氣膜和液膜阻力；耗氧方面的阻力主要是細胞團與細胞膜阻力引起！

第七章 發(fā)酵工程控制1、發(fā)酵工業(yè)中溶解氧為什么很容易成為控制因素？答：溶氧是需氧微生物生長所必須的，對細胞生長和產(chǎn)物合成有較大影響，由于氧在水中的溶解度很低，所以在需氧微生物發(fā)酵過程中溶解氧往往最易成限制因素。溶解氧在發(fā)酵過程控制中起重要作用：溶解氧判斷操作故障或事故引起的異常現(xiàn)象；溶解氧判斷中間補料是否恰當；溶解氧判斷發(fā)酵體系是否污染雜菌；溶氧作為控制代謝方向的指標。2、最佳pH的選擇：選擇最適發(fā)酵pH的準則是獲得最大比生產(chǎn)速率和適當?shù)木浚换锏淖罡弋a(chǎn)量。一般pH調(diào)控有以下幾種方法：① 配制合適的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH至合適范圍并使其也很好的緩沖能力；② 培養(yǎng)過程中加入非營養(yǎng)基質(zhì)的酸堿調(diào)節(jié)劑，如CaCO3等防止pH過度下降；③ 培養(yǎng)過程中加入基質(zhì)性酸堿調(diào)節(jié)劑，如氨水等；④ 加生理酸性或堿性鹽基質(zhì)，通過代謝調(diào)節(jié)pH；⑤ 將pH控制與代謝調(diào)節(jié)結(jié)合起來，通過補料來控制pH。3、溫度對發(fā)酵的影響：在過程優(yōu)化中應(yīng)了解溫度對生長和生產(chǎn)的影響是不同的，溫度對菌的生長和生產(chǎn)的影響的各種因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果。從酶動力學看，溫度升高，反應(yīng)速率加大，生長代謝速度加快，生產(chǎn)期提前，但因酶本身很容易因過熱而失去活性，溫度越高，酶的失活也越快，表現(xiàn)為菌體易于衰老，發(fā)酵周期縮短，影響產(chǎn)物的最終產(chǎn)量。溫度除了直接影響過程的各種反應(yīng)速率外，還通過改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)來年影響產(chǎn)物的合成，溫度還會影響生物合成的方向，對代謝有調(diào)節(jié)作用，一般生物的活化能越高，對溫度越敏感。 最適溫度：是指最適于菌的生長或產(chǎn)物的生成的溫度，它是一個相對概念，是在一定發(fā)酵條件下測定的結(jié)果。不同的菌種、不同培養(yǎng)條件以及不同的生長階段，最適溫度會有所不同。由于最適合菌體生長的溫度不一定適合發(fā)酵產(chǎn)物的合成，故在實際發(fā)酵過程中往往不能在整個發(fā)酵周期內(nèi)僅選一個最適培養(yǎng)溫度，而需建立二階段發(fā)酵工藝。4、泡沫對發(fā)酵的影響及控制：一般在含有復合氮源的通氣發(fā)酵中會產(chǎn)生大量泡沫，引起“逃液”，給發(fā)酵帶來許多副作用，主要表現(xiàn)在：1）降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)；2）增加了菌群的非均一性；3）增加了污染雜菌的機會；4）大量氣泡，控制不及時，會引起逃液，招致產(chǎn)物的流失；5）消泡劑的加入會影響發(fā)酵或給提煉工序帶來麻煩?？刂婆菽姆椒ㄓ袡C械消泡和消泡劑消泡。5、高密度發(fā)酵：指培養(yǎng)液中工程菌的濃度在50g干重/L以上，理論上最高值可達200g干重/L。6、呼吸商：指生物體在同一時間內(nèi)，釋放二氧化碳與吸收氧氣的體積之比或摩爾數(shù)之比，即指呼吸作用所釋放的CO2和吸收的O2的分子比。

第八章 發(fā)酵設(shè)備

編輯切換為居中

1.通風發(fā)酵罐的類型：機械攪拌發(fā)酵罐、氣升式發(fā)酵罐、自吸式發(fā)酵罐、伍式發(fā)酵罐、文氏管發(fā)酵罐2、攪拌的作用：①液體通風后進入的氣泡在攪拌中隨著液體旋轉(zhuǎn)使之所走路程延長，使發(fā)酵液中保持的空氣數(shù)量增加，實際上是增加了傳質(zhì)量；②通過攪拌，大氣泡被攪拌器打碎，增加比表面積,增加氣液接觸面積；③攪拌速度越快，攪拌雷諾準數(shù)增加，增加了傳氧速率。3、啤酒發(fā)酵罐由于操作失誤就可能造成罐內(nèi)真空甚至被吸癟? 答：因為放料速度和倒灌速度過快，洗滌劑是堿性的，與二氧化碳中和，導致真空。4、通氣式攪拌發(fā)酵罐中的平直葉渦輪攪拌器為什么要安一個圓盤呢？ 答：因為不安圓盤的話，氣泡直接將進入發(fā)酵罐中，對發(fā)酵不利；安裝了圓盤的話，可以將氣泡打碎，增加氣液接觸面積，使全體攪拌更均勻，避免造成浪費。清洗也更方便。5、擋板的作用：改變液流的方向，由徑向流改為軸向流，促使液體激烈翻動，增加溶解氧。

消泡器的作用：將泡沫打碎。輻射的作用：使灌頂和罐底軸之間的縫隙加以密封，防止泄漏和污染雜菌。