培養(yǎng)基的顏色主要來自酚紅，酚紅指示顏色非常靈敏，pH值范圍為6-8，顏色由黃變?yōu)樽霞t。為了培養(yǎng)方便，能讓我們直觀地感覺培養(yǎng)液的狀況，加入酚紅后，如果培養(yǎng)液偏酸，就顯示偏黃色，偏堿性則會顯示偏紫色。一般來說，污染細菌或者長時間不換液時，培養(yǎng)基變成黃色，主要是因為細菌和細胞過度增長，產生了酸性物質。開封后的培養(yǎng)基保存在4℃冰箱中，培養(yǎng)基內的二氧化碳會逐漸溢出，pH偏堿性，所以培養(yǎng)基就偏紫色了。

偏紫色的培養(yǎng)基，可以通入無菌過濾的二氧化碳，調整pH值后繼續(xù)使用。長時間沒用完的堿性培養(yǎng)基不建議繼續(xù)使用，會造成細胞生長停滯或死亡。

?細胞培養(yǎng)中應注意問題?

1.細胞培養(yǎng)液中一定要加HEPES，作用是穩(wěn)定液體的PH。HEPES的化學全稱位呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。

2.以培養(yǎng)基顏色的變化作為換液的指標，是不夠，但很實用。因為培養(yǎng)液中有指示劑酚紅存在，故液體顏色的變化可間接提示細胞生長的狀態(tài)。細胞生長旺盛，產酸，液體呈黃色；反之，液體會呈紫紅色。

3.在觀察細胞時，液體ph變化大，會對細胞產生傷害，對細胞生長不利。

4.是否所有的細胞培養(yǎng)基均適用同樣的CO2濃度？

其實不然，CO2濃度的選擇取決于NaHCO3濃度。CO2和溶液中的-HCO3形成緩沖體系，使得整個培養(yǎng)體系的pH值維持在弱堿性(7左右)，這也是哺乳動物細胞生長的最適pH值。當培養(yǎng)基長時間暴露在空氣中是，-HCO3會迅速分解，pH值快速升高，視覺觀感上即是從紅變紫。當再次將培養(yǎng)基放到細胞培養(yǎng)箱中后，在CO2的作用下，又會緩慢地從紫變回紅色。

不同的細胞培養(yǎng)基的NaHCO3濃度不一樣，使用不用的細胞培養(yǎng)基應選擇與之對應的CO2濃度：

NaHCO3 (g/L) 濃度<1.5時，所需CO2濃度為4%；

NaHCO3 (g/L) 濃度處于1.5-2.2時，所需CO2濃度為5%；

NaHCO3 (g/L) 濃度處于2.2-3.4時，所需CO2濃度為7%；

NaHCO3 (g/L) >3.5時，所需CO2濃度為10%。

隨著細胞不斷生長，pH值逐漸不斷下降（由于乳酸的代謝性積累），培養(yǎng)基會變成黃色。當我們發(fā)現培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的pH發(fā)生不正常地變化時，我們需要這樣做：

1.確定是否使用不當的二氧化碳濃度：依據培養(yǎng)基中的碳酸氫鈉濃度來增加或降低培養(yǎng)箱中的二氧化碳百分比。對于2.0至3.7 g/L的碳酸氫鈉，分別使用5-10%的二氧化碳濃度。或換用不依賴二氧化碳的培養(yǎng)基。

2.確定是否組織培養(yǎng)瓶蓋子過緊：將蓋子擰松1/4圈。

3.確定是否碳酸氫鹽緩沖不充分：加入HEPES緩沖液，使最終濃度達到10-25 mM。

4.確定是否培養(yǎng)基中含有錯誤的鹽分：請在CO2條件下使用Earle's鹽培養(yǎng)基，在大氣環(huán)境下使用Hanks'鹽培養(yǎng)基。

5.確定是否細菌，酵母或真菌污染：丟棄培養(yǎng)物及培養(yǎng)基，嘗試對培養(yǎng)物進行去污染。

?DMEM培養(yǎng)基常見問題?

為什么DMEM培養(yǎng)基是鮮紅色

培養(yǎng)基的顏色主要是酚紅來顯示的，酚紅指示顏色非常靈敏，p值范圍為6-8，顏色由黃變?yōu)樽霞t。酚紅不是必須的，在有些情況下甚至是多余的，酚紅有類似固醇類激素的作用，如果涉及到固醇類激素相關的細胞培養(yǎng)，最好不要添加。但是為了培養(yǎng)方便，能讓我們直觀地感覺培養(yǎng)液的狀況，加入酚紅后，如果培養(yǎng)液偏酸了，就顯示偏黃色，偏堿性了就顯示偏紫色。

為什么培養(yǎng)皿放在一個沒有開啟CO2的孵箱里面，培養(yǎng)液顏色偏紫色

一般的DMEM使用的緩沖體系是NaHCO3， 初中的時候應該見過如下的方程2NaHCO3=Na2CO3+CO2+H2O在沒有CO2的孵箱中，培養(yǎng)液中的CO2一直溢出，碳酸變少了，溶液變堿性了，就偏紫色了。同時我們打開了很久的DMEM瓶里面的培養(yǎng)液也會慢慢偏紫色，也就是這個道理。

培養(yǎng)基偏紫色了還能用不

可以將該偏紫色的培養(yǎng)基置于CO2孵箱中，擰松瓶蓋。一段時間之后你會發(fā)現顏色變?yōu)轷r紅色了，那么可以繼續(xù)接著用。但是不要使用過長時間未用完并且變色的培養(yǎng)液，置于空氣下氧化之后培養(yǎng)基成分可能已發(fā)生了變化。

在細胞培養(yǎng)過程中，檢查培養(yǎng)液顏色與透明度的變化，顏色變黃，說明PH值下降；變紅或紫紅色，說明PH值上升，細胞生長停滯、死亡，一般生長穩(wěn)定的細胞2-3天換液一次，生長緩慢的細胞可3-4天換液一次。

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