腫瘤微環(huán)境方向CNS級別文章頻發(fā)，你還不心動嗎？

不知道怎么研究沒關系，剖析一下思路立馬get！

再從Natrue文章總結生信分析的靈活應用~

今天小云想給大家解讀一篇11月份發(fā)表的Nature文章，題目是腫瘤中性粒細胞的鐵死亡導致癌癥中的免疫抑制。從題目中可以看出文章是研究：腫瘤中性粒細胞的鐵死亡能夠影響免疫抑制的。

那么作者是如何想到要研究這個方向呢？

（1）第一步，需要找到要解決的問題或目前研究的瓶頸：

鐵死亡在腫瘤細胞中研究的比較多了，也開發(fā)出了一些鐵死亡誘導劑用于殺傷腫瘤細胞，在體外細胞實驗和免疫缺陷小鼠中的效果十分顯著，但在免疫功能正常的動物模型中并沒有明顯的效果。說明當前的研究只關注了腫瘤細胞本身，而沒有關注腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞！即鐵死亡對免疫細胞的影響尚不清楚。

（2）第二步，如何確定要研究哪一種免疫細胞呢？

作者發(fā)現(xiàn)2020年有一篇文章報道了人類結直腸癌肝轉移的PMN-MDSCs的單細胞轉錄組分析，結果顯示PMN-MDSCs鐵死亡途徑基因顯著富集，表明這些細胞對鐵死亡的敏感性更高。

（3）第三步：整理思路，提出假說：

病理激活的中性粒細胞(PMNs)，稱為髓系來源的抑制細胞(PMN-MDSCs)，能夠抑制抗腫瘤免疫?；谏鲜龅难芯窟M展，作者推測腫瘤微環(huán)境中的PMN-MDSCs會更容易發(fā)生鐵死亡，并會對抗腫瘤免疫產(chǎn)生影響。

福爾摩斯·小云推測：作者的這一想法應該誕生于2020年，然后作者開始設計課題證實猜想，用1年多的時間得到數(shù)據(jù)并投稿，修修補補就來到了2022年正式被Nature接收并發(fā)表。

研究思路

有了研究假說，如何設計課題思路去證實呢？

總結一下可以按照以下流程進行：確定要研究的大體方向/要解決的臨床問題→通過文獻調(diào)研提出科學假說→利用自測/公共數(shù)據(jù)進行相關性分析→實驗驗證→組學+生信分析篩選關鍵分子并驗證→增加臨床意義（治療方法+臨床數(shù)據(jù)分析）。

沒有思路、不知道怎么利用生信分析的找小云，畢竟分析貫穿了整個課題哦！

（1）通過生信分析證實PMN-MDSC與鐵死亡的關系：用自測數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù)

這篇文章的作者是對小鼠和人PMN-MDSC進行了RNA-seq。

分組：①肺癌患者的血液(TBB)和腫瘤組織(TBT)以及健康對照者的外周血(HD)中PMN-MDSCs；②荷瘤小鼠CD14high和CD14?PMN-MDSCs。

生信分析發(fā)現(xiàn)腫瘤PMN-MDSCs中參與調(diào)節(jié)鐵死亡的幾個基因的上調(diào)，說明PMN-MDSCs更易受鐵死亡的影響。

基于數(shù)據(jù)中差異最大的八個鐵死亡基因構建鐵死亡signature，利用單細胞RNA-seq（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集，證實腫瘤PMNs-MDSCs中鐵死亡signature更高。

（2）通過實驗驗證PMN-MDSCs更易受鐵死亡的影響：

利用人和小鼠的PMN-MDSCs驗證鐵死亡相關指標的變化，包括鐵死亡相關基因的表達、脂質分子的累積、鐵死亡抑制劑和誘導劑的應用，證實生信分析的結果，即PMN-MDSCs更易受鐵死亡的影響，在腫瘤微環(huán)境中會發(fā)生鐵死亡。

（3）實驗證實腫瘤PMN-MDSCs鐵死亡對T細胞的抑制作用：

用鐵死亡誘導劑RSL3處理無腫瘤小鼠的骨髓PMN（BM-PMNs）后，發(fā)現(xiàn)能夠抑制CD8+T細胞的增殖。利用基因敲除小鼠證實鐵死亡缺陷的PMNs對T細胞的免疫抑制作用消失了。而且這種抑制作用是由可溶性因素介導的，因為PMNs上清液能夠抑制T細胞增殖，鐵死亡抑制劑可以挽救這一效果。說明鐵死亡在腫瘤PMN-MDSCs的免疫抑制活性中具有重要作用，但對脾臟PMN-MDSCs沒有影響。同時，從腫瘤患者組織中分離出PMN-MDSCs也觀察到鐵死亡介導的PMNs向免疫抑制的PMN-MDSCs轉化。

（4）利用組學和生信分析探究機制并驗證：

對鐵死亡誘導劑RSL3處理的BM-PMNs進行RNA-seq分析，并對小鼠腫瘤PMN-MDSCs進行代謝組學分析。找到了關鍵的分子PGE2和脂肪酸轉運蛋白FATP2、骨髓過氧化物酶（MPO），并通過實驗證實它們的作用。

（5）臨床轉化意義：

1）通過抑制鐵死亡抑制腫瘤生長：

動物模型證實了鐵死亡抑制劑對腫瘤的抑制作用，同時鐵死亡抑制劑還能增強PD-1抗體阻斷免疫檢查點的抗腫瘤效果。用Ly6G抗體耗盡中性粒細胞后，鐵死亡抑制劑的抗腫瘤作用消失了，表明PMN-MDSCs是鐵死亡抑制劑抑制腫瘤的關鍵細胞。鐵死亡抑制劑會增加常駐記憶、中央記憶和效應性CD8+T細胞以及自然殺傷細胞在腫瘤組織中的浸潤，并通過scRNA-seq證實了T細胞的激活。

2）臨床數(shù)據(jù)的分析和實驗驗證：

利用TCGA、免疫治療等數(shù)據(jù)集評估鐵死亡基因signature與PMN-MDSC、患者生存預后的相關性，發(fā)現(xiàn)PMN-MDSC和鐵死亡特征之間呈正相關，以及鐵死亡基因表達較低的患者生存率顯著增加。

總結

這項研究證明在腫瘤微環(huán)境（TME）中，PMN-MDSCs會發(fā)生鐵死亡，這使它們具有更強的免疫抑制性。誘導鐵死亡足以使非抑制性PMNs轉化為免疫抑制性PMN-MDSCs。雖然鐵死亡減少了TME中PMN-MDSCs的數(shù)量，但鐵死亡細胞釋放的免疫抑制分子發(fā)揮了對T細胞的抑制作用。抑制 PMN-MDSCs鐵死亡能夠抑制腫瘤生長。

另外，Nature子刊上的一篇報道發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡之后，會對周圍抗原遞呈細胞產(chǎn)生抑制作用，抑制免疫細胞的功能，促進腫瘤的免疫逃逸。

而且，抑制CD8+T細胞的鐵死亡可有效恢復其抗腫瘤活性。

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鐵死亡在腫瘤中具有雙重作用，這些結果進一步突出了鐵死亡對于腫瘤微環(huán)境的作用。在TME中不同細胞的鐵死亡產(chǎn)生的不同效果要加以考慮，可以針對不同的細胞特異性靶向應用鐵死亡抑制劑或誘導劑，以取得最佳效果。