第一章 ?細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第一節(jié) 細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法

一、光學(xué)顯微鏡

（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡

顯微鏡的重要參數(shù)：分辨率（能區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離）其高低取決于光源的波長λ，物鏡鏡口角α（標(biāo)本在光軸上的一點(diǎn)對物鏡的張角）和介質(zhì)折射率N，其之間的關(guān)系是：

光學(xué)顯微鏡可以直接用于觀察單細(xì)胞生物或體外培養(yǎng)細(xì)胞。如果是觀察生物組織的樣品，需要進(jìn)行固定、包埋（常用甲醛固定，石蠟包埋）、切片和染色（如HE染色法【即蘇木精和伊紅染色：堿性染料蘇木精和酸性的伊紅分別與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的某些成分特異性結(jié)合從而改變透射光的波長】）

（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡

活細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)可以借助相差顯微鏡來進(jìn)行觀察

光波的基本屬性包括：波長、頻率、振幅和相位。波長和頻率的變化表行為顏色的區(qū)別，振幅的變化表現(xiàn)為亮暗的區(qū)別，相位的變化是人眼無法察覺的（兩束光通過光學(xué)系統(tǒng)時(shí)，會發(fā)生互相干涉。如果其相位相同，干涉的結(jié)果是使光的振幅增大，亮度增強(qiáng)，反之減弱）。相差顯微鏡利用這點(diǎn)增強(qiáng)樣品的反差，實(shí)現(xiàn)對非染色活細(xì)胞的觀察

【微分干涉顯微鏡：以平面偏振光為光源。光線經(jīng)棱鏡折射后被分成兩束，在不同的時(shí)間通過樣品，然后再經(jīng)過另外一束棱鏡將光線匯合，使樣品中的差別轉(zhuǎn)換成亮暗的差別】

（三）熒光顯微鏡

在光鏡的水平下對細(xì)胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂質(zhì)進(jìn)行定位性研究

熒光顯微鏡的樣品制備技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)（見第二節(jié)）和熒光素直接標(biāo)記技術(shù)（熒光染料DAPI特異性地直接與細(xì)胞中的DNA結(jié)合，從而顯示出細(xì)胞核或者是染色體地定位）

（四）激光共聚焦顯微鏡

在熒光顯微鏡中許多來自于焦平面以外的熒光會導(dǎo)致觀察的圖像反差變小，分辨率降低。激光共聚焦顯微鏡（LSCM）相當(dāng)于在熒光顯微鏡上安裝了一套激光共聚焦成像系統(tǒng)，并以激光或紫外光為光源，極大的提高了分辨率

二、電子顯微鏡（EM）

（一）電子顯微鏡的基本知識

1.與光鏡的區(qū)別：用電子束作為光源

2.分辨率和分辨本領(lǐng)：分辨本領(lǐng)是指電鏡在最佳狀態(tài)下的分辨率

3.電子顯微鏡的基本構(gòu)造【略】

（二）主要的電鏡制樣技術(shù)

1.超薄切片技術(shù)：固定（戊二醛和四氧化鋨【即鋨酸】）、包埋（包埋前要經(jīng)過脫水處理【包埋劑大多都是疏水性質(zhì)】）、切片和染色（用重金屬鹽進(jìn)行染色）

2.負(fù)染色技術(shù)

用重金屬鹽（磷鎢酸或醋酸雙氧鈾）對于鋪載在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色，吸去多余染料，樣品自然干燥之后，整個(gè)載網(wǎng)上都會鋪滿重金屬鹽，從而襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)

3.冷凍蝕刻技術(shù)

分為冰凍斷裂和蝕刻復(fù)型技術(shù)。圖像具有立體感

4.電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)【略】

5.掃描電鏡技術(shù)

電子槍發(fā)射出的電子束被磁透鏡匯聚成電子探針，在樣品表面進(jìn)行掃描，激發(fā)樣品表面釋放出二次電子。二次電子被感受器接收，并轉(zhuǎn)換成光信號，其產(chǎn)生多少和樣品表面有關(guān)。所以掃描電鏡可以得到樣品表面的立體圖像結(jié)構(gòu)信息

三、掃描隧道顯微鏡（STM）

利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)，即在通常電壓下，兩電極之間有很大的阻抗，阻止電流的通過，稱為勢壘。當(dāng)兩電極之間近到一定的距離（50nm以內(nèi)）時(shí)，電極之間產(chǎn)生了電流稱為隧道電流，即隧道效應(yīng)。且隧道電流和針尖的距離呈指數(shù)關(guān)系，由此樣品表面的形貌可以測定。

第二節(jié) 細(xì)胞及其組分的分析方法

一、超離心技術(shù)

利用各種技術(shù)將細(xì)胞質(zhì)膜破碎，形成各種細(xì)胞器和細(xì)胞組分組成的混合勻漿，再通過差速離心將各種不同質(zhì)量和密度的亞細(xì)胞組分分開

密度梯度離心是將要分離的細(xì)胞組分鋪放在含有密度逐漸增加的高溶解性的惰性物質(zhì)形成的密度梯度溶液表面，通過重力或者是離心力使樣品中的不同組分以不同的速率進(jìn)行沉降

速度沉降用于分離密度相近而大小不一的細(xì)胞組分，離心前將要分離的物質(zhì)放在溶液的上層，各種細(xì)胞組分再根據(jù)其大小以不同速度進(jìn)行沉降，形成不同的沉降帶

等密度沉降主要是用于分離密度不一的細(xì)胞組分，細(xì)胞組分在連續(xù)梯度的高密度介質(zhì)中經(jīng)離心力場長時(shí)間作用沉降或漂浮到與自身密度相等的位置，形成不同的沉降帶

二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法

利用顯色劑與某一細(xì)胞組分特異性結(jié)合的性質(zhì)

福爾更反應(yīng)可以特異性地顯示呈紫紅色的DNA的分布

PAS反應(yīng)通過醛基和堿性品紅反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物確定多糖的存在

四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈現(xiàn)黑色，用來證明脂滴的存在。而蘇丹Ⅲ（深紅色）染色則通過擴(kuò)散進(jìn)入脂滴之中，使脂滴著色

米倫反應(yīng)用氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng)，形成紅色沉淀。

在重氮反應(yīng)中，氫氧化重氮與酪氨酸、色氨酸和組氨酸起反應(yīng)，形成有色復(fù)合物

蛋白質(zhì)中的巰基可用形成硫醇鹽共價(jià)鍵的試劑進(jìn)行檢測

三、特異蛋白抗原的定位與定性

（一）免疫熒光技術(shù)

用免疫學(xué)方法（抗體-抗原結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合用于研究特異性蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布（分為直接【熒光分子與第一抗體結(jié)合，第一抗體識別抗原】和間接【熒光分子與第二抗體結(jié)合，第二抗體識別第一抗體-抗原復(fù)合物】兩種方法）

（二）免疫電鏡技術(shù)

分為免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和免疫酶標(biāo)技術(shù)，三者區(qū)別在于與抗體結(jié)合的標(biāo)志物不同

四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

常采用原位雜交技術(shù)，用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特異核酸序列在染色體上的定位

五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)可以定量的測定某一細(xì)胞中DNA、RNA或某一特異的標(biāo)記蛋白的含量，以及細(xì)胞群體中上述含量不同的細(xì)胞數(shù)量，還可以用于細(xì)胞的分選或者是分離某一特意染色的細(xì)胞從數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞群體中分離出來

第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程

一、細(xì)胞培養(yǎng)【略】

二、細(xì)胞工程【略】

第四節(jié) 細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化

一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)【略】

二、單分子技術(shù)

分為單分子光譜及成像（基于分子的內(nèi)凜光譜以及與周圍環(huán)境和分子的作用來測量單一分子對于光的響應(yīng)或者是對于化學(xué)條件的響應(yīng)）和單分子操縱及力學(xué)性質(zhì)測量（常見方法有光攝、磁攝和原子力顯微鏡）

三、酵母雙雜交技術(shù)

利用單細(xì)胞真核生物酵母在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。

細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，轉(zhuǎn)錄激活因子一般由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。酵母雙雜交利用此原理：證明A是否與B蛋白在細(xì)胞中發(fā)生作用，或者是尋找與蛋白A可能發(fā)生作用的蛋白，可以分別制備DB（DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域）和蛋白A的融合蛋白（即誘餌，bait），以及AD（轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）與蛋白B或可能與蛋白A發(fā)生作用的融合蛋白（即獵物，prey）。如果蛋白A與蛋白B或者是其他蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合，將會形成與轉(zhuǎn)錄激活因子相類似的復(fù)合物，啟動報(bào)告基因的表達(dá)

四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）

用來檢測活細(xì)胞中兩種蛋白分子是否直接相互作用。

在一定的波長激光的照射下，只有攜帶發(fā)光基因的分子才可以激發(fā)出波長為A的熒光，而同一激發(fā)光無法激發(fā)攜帶發(fā)光集團(tuán)B的熒光。當(dāng)供體所發(fā)出的熒光光譜A與受體上的發(fā)光集團(tuán)吸收光譜相互重疊，并且兩個(gè)發(fā)光集團(tuán)之間的距離小到一定程度時(shí)（10nm）就會發(fā)生不同程度的能量轉(zhuǎn)移，即受體分子的發(fā)光集團(tuán)吸收了供體所發(fā)出的熒光，并放出了波長為B的熒光，由此認(rèn)為這兩個(gè)蛋白有直接相互作用

五、放射自顯影技術(shù)

利用放射性同位素的電離射線對乳膠（含有溴化銀或者是氯化銀）的感光作用，對于細(xì)胞中的生物大分子進(jìn)行動態(tài)研究和追蹤

第五節(jié) 模式生物與功能基因組的研究【略】

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第二章 ?細(xì)胞質(zhì)膜【略】