生物分離工程
第一講 緒論 2學時
一、通過本章學習應該掌握的內(nèi)容
1、何謂生物分離工程
2、生物分離工程的歷史及其應用
3、生物分離工程在生物技術(shù)中的地位？
4、生物分離工程的特點
5、生物分離工程可分為幾大部分，分別包括哪些單元操作？
6、在設計下游分離過程前，必須考慮哪些問題方能確保我們所設計的工藝過程最為經(jīng)濟、可靠？
二、生物分離工程的發(fā)展歷史
1、 概念：從微生物、動植物細胞及其生物化學產(chǎn)品中提取有用物質(zhì)的技術(shù)
2、生物分離工程的發(fā)展歷史已經(jīng)有幾百年的歷史了——最早的分離技術(shù)有蒸餾、過濾等原始方法
三、The position of Bioseparation in Biotechnology （生物分離在生物技術(shù)中所占位置）
By biotechnology, we mean the use of carefully cultured microorganisms, animal cells, and plant cells to produce products useful to humans.
（所謂生物技術(shù)就是指利用培養(yǎng)微生物、動物細胞、植物細胞來生產(chǎn)對人有用的產(chǎn)品。）
By this definition, biotechnology is as old as history, for the earliest known document (4228BC) includes a description of brewing Bread; cheese, and yogurt are other early examples of product which depend on biotechnology.（按上述定義，早在公元前4228年就有了應用生物技術(shù)釀酒、制奶酪等的記載。）
Today, we restrict biotechnology largely to those areas where chemically defined species are produced .Under this more restricted definition, biotechnology is about 100 year old.（狹義生物技術(shù)的產(chǎn)物僅為化學產(chǎn)品，約有100年的歷史。）
Effective ways to get useful products（獲得產(chǎn)品的有效途徑）
（1）Raw materials（原料）
（2）pretreatments（預處理）
（3）bioreactions（生物反應）
（4）bioseparations（生物分離）
（5）products（產(chǎn)品工程）
四、生物分離的應用
1、醫(yī)藥：抗生素、激素、維生素
2、食品：乳酪
3、化工：氨基酸
4、精細化工：化妝品、香料
5、農(nóng)業(yè)：手性農(nóng)藥
6、生物：酶
五、生物分離過程的特點
1、 產(chǎn)品豐富
2、
A chief characteristic of biotechnology is the tremendous variety of products which are produced. This diversity of products spawns the broad spectrum of separation methods used.（產(chǎn)品的多樣性導致分離方法的多樣性）
2、most bioseparation methods come from chemical separations（絕大多數(shù)生物分離方法來源于化學分離）
3、Bioseparations are more difficult than chemical separations.（生物分離一般比化工分離難度大）
（1）Complex components（成分復雜）
（2）Desired products in dilute suspension（懸液中的目標產(chǎn)物濃度低）
青霉素含量為3.6％，慶大霉素為0.2％，胰島素僅為0.001％
（3）Biological activity（生物活性）
條件相對溫和
（4）Biological products require high quality （生物產(chǎn)品要求高質(zhì)量）
（5）Get highly purified dry products（獲得高純度的干燥產(chǎn)品）
（6）Sanitation（衛(wèi)生）
因此，生物分離過程往往成本很高，在某些產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，分離成本可能占到總成本的80％以上
Thus the recovery and the purification processes must be well conceived and well designed.（因此必須仔細考慮和設計產(chǎn)品的回收和純化過程）
We have found that our own designs have been improved by answering the following questions: （設計中應考慮下列問題）
（1）What is the value of the product?（產(chǎn)品價值）
（2）What is an acceptable product quality?（產(chǎn)品質(zhì)量）
（3）Where is the product in each process stream?（產(chǎn)物在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的位置）
（4）Where are the impurities in each process stream?（雜質(zhì)在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的位置）
（5）What are the unusual physicochemical properties of the product and the principal impurities?（主要雜質(zhì)獨特的物化性質(zhì)是什么？）
（6）What are the economics of various alternative separations?（不同分離方法的技術(shù)經(jīng)濟比較）
Careful consideration of these questions can provide clues that will lead to optimal processes for the recovery of products of adequate quality coupled with high recovery and minimum effort. （上述問題的考慮將有助于優(yōu)質(zhì)、高效產(chǎn)物分離過程的優(yōu)化）
六、生物分離的一般步驟
From our experience, we find that most bioseparations have four similar steps:
（生物分離一般分四步）
1、不溶物的去除（固液分離）Removal of insolubles
filtration、centrifugation、cell disruption (necessary when the desired product is intracellular.)
Relatively little product concentration or improvement of product quality occurs. （提高產(chǎn)物濃度和質(zhì)量）
2、雜質(zhì)粗分（濃縮）
adsorption - ion-exchang（離子交換吸附）
extraction（萃取）
solvent extraction（溶劑萃?。?/p>
reversed micelle extraction（反微團萃?。?/p>
supercritical fluid extraction（超臨界流體萃取）
aqueous phase extraction（雙水相萃?。?/p>
These steps, which are relatively nonspecific, remove materials of widely divergent properties compared to the desired product. （以上分離過程不具備特異性，只是進行初分）
Appreciable concentration and product quality increases usually occur.（可提高產(chǎn)物濃度和質(zhì)量）
3、純化
chromatography（色譜）
electrophoresis（電泳）
precipitation（沉淀）
These processing technology are highly selective for the product and remove impurities of similar chemical functionality and physical properties.（以上技術(shù)具有產(chǎn)物的高選擇性和雜質(zhì)的去除性）
4、精制
crystallization（結(jié)晶）
drying （干燥）
七、本章作業(yè)
1、生物分離工程在生物技術(shù)中的地位？
2、生物分離工程的特點是什么？
3、生物分離工程可分為幾大部分，分別包括哪些單元操作？
4、在設計下游分離過程前，必須考慮哪些問題方能確保我們所設計的工藝過程最為經(jīng)濟、可靠？
第二講 過濾 2學時
一、通過本章學習應掌握的內(nèi)容
1、何謂過濾
2、過濾的基本形式
3、凝聚和絮凝的區(qū)別
4、常用的絮凝劑有哪些
5、過濾設備分類
6、常用過濾設備及其特點
二、過濾的基本概念
過濾是在某一支撐物上放過濾介質(zhì)，注入含固體顆粒的溶液，使液體通過，固體顆粒留下，是固液分離的常用方法之一。
Filtration separates solid from a liquid by forcing the liquid through a solid support or filter medium. This is a straight forward procedure for well defined crystals.
三、過濾前物料的前處理
However the small size of microorganisms make filtration of fermentation beers or other biological solutions considerably more complicated. Generally, fermentation beers and other biological solutions are notoriously hard to filter. They are often hard to filter because of high non-Newtonian viscosity or highly compressible cakes. That is to say, we must modified these procedures for bio-separations.
通常發(fā)酵液和生物溶液是高粘度的和非牛頓流體，是很難過濾的，為了加快過濾速度，通?？刹捎靡韵路椒ǎ?/p>
1、加熱（Heating）——降低液體粘度
2、凝聚和絮凝（Coagulation and flocculation）——在電介質(zhì)作用下，破壞溶質(zhì)膠體顆粒表面的雙電層，破壞膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程
四、影響凝聚作用的主要因素
Simple electrolytes act by screening the electrostatic repulsion, which commonly exists between colloidal particles. When this electrostatic repulsion is reduced, attractive London-vander waals forces predominate. The colloids can then coagulate as larger, dense particles which are more easily filtered. (簡單電解質(zhì)降低膠體間的排斥力。從而范德華引力起主導作用，聚合成較大的膠粒，粒子的密度越大，越易分離。)
1、無機鹽的種類
2、無機鹽的化合價
3、無機鹽的用量
常用的凝聚劑有：
Al2(SO4)3.18(H2O)，AlCl3.6(H2O)，F(xiàn)eCl3，ZnSO4，MgCO3
五、絮凝作用(Flocculation)
概念：指在某些高分子絮凝劑存在下，在懸浮粒子之間發(fā)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團的過程
Synthetic polyelectrolytes added as pretreatments can both reduce electrostatic repulsion and adsorb on adjacent particles, forming bridges between them. As a result, the colloidal particles flocculate as large, less dense aggregates which are more easily filtered. These polyelectrolytes can be anionic, cationic or nonionic.（合成助濾劑既降低靜電斥力又吸附周圍的微粒，形成橋架作用。膠粒過大，就發(fā)生絮凝，低密度聚合的膠粒，容易過濾。聚合電解質(zhì)有陽離子型、陰離子型或非離子型。
六、常用的絮凝劑
1、天然聚合物
多糖類物質(zhì)、海藻酸鈉、明膠等
2、人工合成聚合物
聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物、聚丙烯酸類等
七、助濾劑
1、目的：助濾劑是一種具有特殊性能的細粉或纖維，它能使某些難以過濾的物料變得容易過濾
2、常用的助濾劑：
硅藻土（Diatomaceous earths）
珍珠巖（Perlites）
八、General Theory for Filtration
Fluid mechanics for filtration Darcy’s law （Darcy方程）for incompressible cake, simplest case（適用于不可壓縮和簡單的可壓縮濾餅）for compressible cake, common for bio-separations（普遍使用于生物分離過程。）
1、Darcy’s law（達西定律）
?V=k △P/μl (2.1)
?where
V－velocity of the liquid
? k—proportionality constant (usually called the Darcy’s law permeability of the bed) （K比例常數(shù),過濾床滲透性的達西方程參數(shù)））
△P－the pressure drop across the bed of thickness （壓降）
μ－ viscosity of the liquid （流體粘度）
*當Re<5時達西定律才成立
?For batch filtration the velocity is（板框式過濾流速方程）
? V=(1/A)*dV/dt (2.2)
A－filtration area （過濾面積）
V－the total volume of filtration（濾液總體積）
t－the filtration time（過濾時間）
?有
l/k= Rm + Rc （2.3）
Rm——the resistance of the filter medium RM （過濾介質(zhì)的阻力）
Rc——the resistance of accumulate cake bio-mass （濾餅的阻力）
2、Incompressible Cakes（不可壓縮濾餅）
If the cake is in compressible (rigid), the cake thickness is directly proportional to the filter area. （不可壓縮濾餅厚度正比于過濾的體積）
As a result the cake’s resistance Rc is
Rc=αρo(V/A) (2.4)
?where
α－represents the specific cake resistance （濾餅的阻力特性）
ρo－the mass of cake solids per volume of filtrate （單位體積濾液含固體濾餅量）
3、Compressible cake（可壓縮的濾餅）
Almost all cakes formed of biological materials are compressible, and so cannot be described with the simple equation just outlined. As these cakes compress, filtration rates drop. （大多數(shù)生物濾餅都可壓縮，不能僅用作圖法描述，濾餅可壓縮，則過濾速度降低）
?α=α’(△P)s
?Where
α’－a constant related largely to the size & shape of the particles forming the cake.（α’與粒子大小和形狀相關(guān)）
S － the cake compressibility
（s是壓縮系數(shù)）
S=0 a rigid & highly incompressible cake （理想的不可壓縮s=0）
S=1 a highly compressible cake （高度可壓縮 s=1）
S=0.1-0.8 in practice （變化范圍從0到1）
Values of S & α’ are most easily determined by plotting the logarithm of αversus the logarithm of △P as shown in fig.(2.1)（計算s和α’可用logα對log△P作圖）
九、Continuous Rotary Filter 連續(xù)旋轉(zhuǎn)式過濾機
We analyze the operation of these units, a filtration cycle on this filter consists of three chief （過濾有三步組成）
1、cake formation（濾餅的形成）
2、cake washing to remove either or unwanted solutes（濾餅的洗滌）
3、cake discharge（濾餅的卸下）
we assume that the resistance of the filter medium Rm is negligible, so that we can use equation (2.5)（假設濾餅阻力不計），the basic expression for filtration
(1/A)*dV/dt = △P/(μ Rc)
initial condition that（初始條件是）
t=0 v=0
Rc = αρo (V/A)
=α’ρo(V/A)( △P)s
tf=(μαρo/(2△P1-s))*(Vf/A)
tf—— the cake formation time （濾餅形成時間）
Vf——the volume of filtrate collected during that period.（濾液流量）
*cake washing（濾餅的洗滌）
作用：
（1）First, it displays the solution-rich broth trapped in pores in the cake.（將濾餅內(nèi)發(fā)酵液洗出）
（2）Second, it allows diffusion of solute out of the biomass in the cake. Such diffusion will enhance recovery, if the desired product is in the biomass.（擴散出生物有機體，這對目標產(chǎn)物在生物有機體很有用）
八、過濾設備及其結(jié)構(gòu)
過濾設備的分類
根據(jù)推動力的不同可分為四類
（a）重力過濾 自然過濾
（b）加壓過濾 板框過濾
（c）真空過濾 真空過濾器
（d）離心過濾 離心過濾器
九、過濾介質(zhì)
1、無定形顆粒：顆?；钚蕴?、沙、無煙煤
2、成形顆粒：燒結(jié)金屬、燒結(jié)塑料
3、非金屬織物：尼龍、玻璃纖維
4、金屬織物：不銹鋼絲網(wǎng)
5、無紡品：紙、石棉
十、典型的過濾設備
1、板框壓濾機
優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單、過濾面積大、操作壓力高、適用范圍廣
缺點：設備笨重、間歇操作、勞動強度大、輔助時間長
2、旋轉(zhuǎn)過濾機
可實現(xiàn)連續(xù)操作
十一、本章作業(yè)
1、何謂過濾
2、過濾的基本形式
3、凝聚和絮凝的區(qū)別
4、常用的絮凝劑有哪些
5、過濾設備分類
6、常用過濾設備及其特點
第三講 離心與沉降 2學時
一、通過本章學習應該掌握的內(nèi)容
1、何謂沉降
2、沉降與離心的異同
3、沉降與離心的速度方程
4、離心設備可分為哪兩大類
5、常用的離心沉降設備有哪些
6、常用的離心過濾設備有哪些
二、離心的概念
The first step in most industrial bioseparations is the removal of insoluble solids from the fermentation beer. The concentration and size of these in solubles varies widely. （生物分離首先去除不溶物）
The size ranges from microorganisms of perhaps 1 um diameter up to insoluble nutrients characteristically 1mm in diameter（粒徑從1um的到1mm）
When these insolubles are dilute, large & rigid, they can be easily separated by filtration. In the previous chapter, we described filtration, including the use of filter aids. For many beers, these filter aids facilitate filtration. For other beers, filter aids are ineffective.（不溶物濃度小，粒徑大，硬度強時用過濾分離。使助濾劑過濾分離，對一些發(fā)酵液很有用）
When the beers are not easily filtered, they sometimes can be separated by centrifugation, which is the subject of this chapter.（不易過濾可用離心）
Centrifugation requires more expensive equipment than filtration. However, it is often effective way even when the solid particles are small & hence hard to filter.
基于固體顆粒和周圍液體密度存在的差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程
實際上離心和過濾一樣，也是固液分離的一種單元操作
對于一些固體顆粒小、溶液粘度大的生物體系，過濾實際上是很難進行的，必須采用離心技術(shù)方能達到目的
三、沉降的概念
沉降：是指當懸浮液靜置時，密度較大的固體顆粒在重力的作用下逐漸下沉，這一過程成為沉降
沉降過程通常是十分緩慢的，對于一些固液密度差異很小的體系沉降往往需要很長時間
四、沉降速率方程
When a solid particle moves through an infinite continuum, its velocity is affected by two forces.
當一固體微粒通過連續(xù)介質(zhì)時，它的運動速度受到兩種力的作用：
1、由于密度差引起的浮力
2、微粒受到的流體阻力
當浮力與阻力達到平衡時，該微粒以恒定的速度沉降
聯(lián)立二式可得沉降速率方程：
五、重力沉降式液固分離設備
1、特點：
設備簡單、運行成本低、能耗低
體積龐大、分離效率低
2、傳統(tǒng)的沉降設備：
（a）矩形水平流動池
（b）圓形徑向流動池
（c）斜板與斜管式沉淀池
六、離心式沉降分離
1、分類：
（a）離心沉降
（b）離心過濾
2、離心沉降
利用懸浮液或乳濁液中密度不同的組分在離心力場中迅速沉降分層，實現(xiàn)固液分離
操作方式：間歇式、連續(xù)式
型式：管式、套筒、碟片式
（1）管式離心機（Tubular bowl）
Simple yet, can provide a very high centrifugal force.（最簡單，可提供較大離心力）
Tubular centrifuges can be cool, a real advantage in protein work.（可用冷卻水冷卻），Suspension is usually fed through bottom, and clarified liquid is removed from the top.（懸浮液由管底進，澄清液由管口流出）
離心過程分析：
To begin this analysis, assume that this typical particle is located at
(1) A distance Z from the bottom of the centrifuge as show in Fig 3.2.1.
(2) Located at position r from the axis of rotation.（離旋轉(zhuǎn)軸為r的微粒）
(3) This position is between the liquid surface R1 & the bowl radius R0.（位于液體界面半徑r1和管心半徑r0的微粒 ）
The particle is moving in both the Z & r directions.
Its movement in the Z direction comes from convection of the feed pumped in the bottom of the centrifuge: （Z方向的動力來源于離心機底部泵入料液的對流）
dz/dt=Q/[π(R02-R12)] (3.8)
Where Q is the feed flow.（料液流速）
The eq(3.8) implies that gravity has only a negligible effect in the Z direction.（ Z方向重力可忽略）
We will assume that the centrifugal force is so high that the liquid interface R1 is constant, independent of Z.（假定離心力很大，R1是常數(shù)）
The particle movement in the r direction is related to its radial position r by (3.7).（r方向上運動與半徑r有關(guān)）
dr/dt= d2(ρs-ρ)rω2/(18μ) (3.9)
We will rewrite this eq. In terms of the velocity of a particle settling under the influence of gravity:
dr/dt=νg(rω2/g) (3.10)
Whereνg is velocity given by Eq.(3.6).
We combine (3.8) & (3.9) to find the trajectory of a particle within the centrifuge:（得出離心機內(nèi)部微粒的運動軌跡）
dr/dz=(dr/dt)/(dz/dt)=νg(rω2/g)π(R02-R12)/Q (3.11)
（2）碟片式離心機（Disc type centrifuge.）
dx/dt=ν0-νcsinθ (3.15)
ν0=[Q/(2πrln)]f(y) （3.16）
n--- the number of discs（蝶片數(shù)）
r--- the distance from the axis of rotation（微粒與轉(zhuǎn)鼓軸線間距離）
l--- the distance between discc
f(y)--- some function giving the velocity variation across the distance between discs . （蝶片間流速變化的函數(shù)）
3、離心過濾
使懸浮液在離心力場作用下產(chǎn)生的離心力壓力，作用在過濾介質(zhì)上，使液體通過過濾介質(zhì)成為濾液，而固體顆粒被截留在過濾介質(zhì)表面，從而實現(xiàn)固液分離，是離心與過濾單元操作的集成，分離效率更高
This is the third, centrifugal filtration; the basket unit shown in fig 3.2-1 d. is really a combination of a centrifuge & a filter. It consists of a perforated basked which rotates rapidly. Suspension is again fed along the axis of the bowl & solid accumulate on the wall of the basket.
We begin the analysis by recalling that the pressure drop Δp in a flat cake is proportional to the fluid velocity v through that cake :
(根據(jù)過濾壓差Δp和流體通過濾餅的速度成正比 )
有：
Δp/l=(μαρ0)ν (3.25)
Where
l--- the thickness of the cake (式中l(wèi)-濾餅的厚度 )
μ--- the fluid velocity (u-料液的粘度)
α--- the specific resistance of the cake(a－濾餅的比阻力 )
ρ0 --- the mass of solid per volume of liquid feed (ρ0－單位體積料液所含的濾渣量)
-dp/dr=(μαρ0)ν (3.26)
2πrlυ=Q (3.27)
由（3.26）和（3.27）
-dp/dr=μαρ0Q/(2πrl) (3.28)
4、常見的離心過濾設備
（a）三足式離心機
是最常見的過濾式離心機，立式有孔轉(zhuǎn)鼓懸掛于三根支足上故而得名
（b）臥式刮刀離心機
可連續(xù)生產(chǎn)，使用效率更高，功率消耗小
（c）螺旋卸料離心機
主要用于需耐壓的場合，具較高的分散因數(shù)
七、本章作業(yè)
1、何謂沉降
2、沉降與離心的異同
3、沉降與離心的速度方程
4、離心設備可分為哪兩大類
5、常用的離心沉降設備有哪些
6、常用的離心過濾設備有哪些
第四講 細胞破碎 2學時
一、通過本章學習應掌握的內(nèi)容
1、細胞破碎的意義
2、常用的細胞破碎方法
3、滲透壓計算方法
4、了解機械破碎法所用設備
5、滲透壓的計算
二、細胞破碎的目的
In some cases, the products of interest are not in the broth but are in the biomass. In particular, most proteins produced in quantity by genetically manipulated bacteria are not excreted into the broth, but are precipitated within the cell. Lipids and some antibiotics are also trapped in the biomass. In a few cases, like baker’s yeast, the desired product is the cell mass itself. In a few others, desired products like steroids can be extracted without rupturing the cells. In many cases, the product is trapped in the biomass: It is intracellular.
Releasing this trapped material usually involves rupturing the cell wall, and is the subject of this short chapter. The methods of cell rupture have largely been developed in biochemistry, and hence are of small scale. Their application to the larger scale operations implied by genetic engineering is speculative. The equipment which is used is not designed for biotechnology. Some equipment is borrowed from the dairy industry, where it was developed for the homogenization of milk; other equipment is taken from the paint industry, where it is used for the size reduction of pigments.
由于有許多生化物質(zhì)存在于細胞內(nèi)部，必須在純化以前將細胞破碎，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到液相中，然后方可進行提取
三、細胞膜
At this point, we pause briefly to explore the physical structure of microbial membranes and the complexity of the problems which we face. At present, knowledge of this general structure does not provide a direct guide to methods of cell rupture. In the future, it may. As a result, we feel that a synopsis has merit. In this synopsis, we emphasize Gram-negative procaryotes.
本節(jié)主要探尋細胞膜的物質(zhì)結(jié)構(gòu)及我們所面對的幾個復雜問題?，F(xiàn)在所有的關(guān)于細胞膜結(jié)構(gòu)的基本知識，并不能為細胞破碎方法提供基本的引導。也許將來可以。正因如此，對此進行提綱切領(lǐng)的介紹很有必要。主要強調(diào)的是革蘭氏陰性原核生物。其細胞結(jié)構(gòu)中沒有細胞核：基因物質(zhì)位于單鏈DNA上。典型的生物是大腸桿菌，是生物技術(shù)研究的主體。通過這種細胞生產(chǎn)了很多細胞重組的產(chǎn)物
三、細胞破碎的主要方法
1、 化學法
The chemical methods of cell rupture listed in Table 4.0-1 are dominated by osmotic shock, detergent so1ubilization, and lipid dissolution. These three methods are described in the following paragraphs. Before this description, we want to give some brief generalizations about the other two methods: enzyme digestion and alkali treatment.
滲透沖擊：無論動物還是植物細胞，胞內(nèi)物質(zhì)都是由膜組織包裹起來的，因此，破壞細胞膜系統(tǒng)是胞內(nèi)物質(zhì)釋放的關(guān)鍵步驟
通常細胞膜系統(tǒng)強度較差，易受滲透壓沖擊而破碎
The simplest of the three major chemical methods is osmotic shock. This is nothing more than dumping a given volume of cells into pure water- often about twice the volume of cells. The cells swell because they contain solutes which cause an osmotic flow of water into the cells. In some cases, they swell so much that they burst. Their contents, released into the surrounding solution, can now be separated using the methods in following chapters.
（最簡單的是滲透沖擊法。此法將一定體積的細胞液加到2倍體積的水中，細胞中溶質(zhì)濃度高，水不斷進入細胞，使細胞膨脹，最后導致破裂。細胞破裂后釋放到周圍環(huán)境中的胞內(nèi)物可用后面章節(jié)介紹的方法分離。）
滲透壓的計算方法
酶消化：酶法破壞細胞膜系統(tǒng)
The disadvantage of enzyme digestion is the cost of the enzymes which. Frequently makes this method prohibitive at a large scale. This is unfortunate, because the method is both gentle and selective. It is nothing more than adding to a cell suspension enzymes which react quickly with the cell walls and destroy them. Because the enzymes selectively catalyze these cell wall reactions, they react only sparingly with other solutes within the cell
（酶消化法的缺點在于酶的消耗限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用，雖然條件溫和、具有選擇性。細胞懸浮液中加入酶能迅速和細胞壁反應并破壞它們。酶選擇性的催化細胞壁反應，不破壞細胞內(nèi)的其它物質(zhì)。）
增溶：利用表面活性劑的增溶作用，將體積為細胞體積2倍的某濃度的表面活性劑溶液加入到細胞中去，表面活性劑能將細胞破碎，制成的懸浮液可通過離心分離除去細胞碎片
The second major method of chemically rupturing cells is solubilization by detergents. Typically,a concentrated detergent solution is added to about half the solution’s volume of cells. The detergent disrupts the cell mem-brane. The resulting suspension can be centrifuged to remove cell frag-ments, and then run through an adsorption column or an extractor to isolate the product.
(最典型的是將體積為細胞體積兩倍的某濃度的表面活性劑加入到細胞中。表面活性劑能將細胞壁破碎，制成的懸浮液可用離心分離除去細胞碎片，再用吸附柱或萃取劑分離制得產(chǎn)品。)
脂溶：在細胞懸浮液中加入一定量的有機溶劑，細胞壁脂質(zhì)層吸收后，導致胞壁膨脹，最后裂開，細胞質(zhì)中的物質(zhì)就釋放到周圍溶液中了
堿處理：
Alkali treatment is the antithesis of enzyme digestion, for it is harsh rather than gentle, nonselective rather than specific, and cheap rather than expensive. Alkali added to a cell suspension reacts with the cell walls in a number of ways, including the saponification of lipids in the cell walls.
(堿處理法和酶消化法相反，反應激烈，不具選擇性，而且較便宜。堿加入細胞懸浮液中后和細胞壁進行了多種反應，包括使磷脂皂化。 )
2、 械法
勻漿法
研磨法
超聲波法：利用頻率高、波長短的超聲波進行細胞破碎，效率更高
球磨破碎法
3、 其它破碎方法
凍結(jié)－融化法（亦稱凍融法）
干燥法
四、本章作業(yè)
1、簡述細胞破碎的意義
2、細胞破碎方法的大致分類
3、滲透壓的計算方法
第五講 萃取 6學時
一、通過本章學習因掌握以下內(nèi)容：
1、 什么是萃取過程？
2、 萃取平衡的條件？
3、液－液萃取的分類？
4、常見物理萃取體系由那些構(gòu)成要素？
5、何謂萃取的分配系數(shù)？其影響因素有哪些？
6、掌握多級萃取萃取級數(shù)的計算方法。
7、萃取設備的選擇方法
8、何謂超臨界流體萃取？其特點有哪些？
9、何謂雙水相萃取?常見的雙水相構(gòu)成體系有哪些？
10、反膠團的構(gòu)成以及反膠團萃取的基本原理
11、反應萃取的基本原理
二、萃取過程
利用在兩個互不相溶的液相中各種組分（包括目的產(chǎn)物）溶解度的不同，從而達到分離的目的
物理萃取、化學萃取
三、物理萃取
利用溶劑對需分離組分有較高的溶解能力，分離過程純屬物理過程
溶質(zhì)：被萃取的物質(zhì)
原溶劑：原先溶解溶質(zhì)的溶劑
萃取劑：加入的第三組分
萃取劑選擇原則：使溶質(zhì)在萃取相中有最大的溶解度
1、 分配系數(shù)：衡量萃取體系是否合理的重要參數(shù)-------- X/Y
2、 萃取分離的基本方程
由物化理論可知：萃取操作達到平衡時，溶質(zhì)在輕相和重相中的化學勢相等。即
由上式可知，分配系數(shù)的對數(shù)值與標準狀態(tài)下的化學勢的差值有關(guān)
因此，要提高溶質(zhì)的分配系數(shù)，必須提高標準狀態(tài)下，其在重相與輕相的化學勢之差。
可以采取的方法有：
（a）改變?nèi)軇?/p>
（b）改變?nèi)苜|(zhì)的特性
l 生成有用離子對－－可溶于萃取劑的離子對
將強酸弱堿鹽或強堿弱酸鹽生成弱酸弱堿鹽
l 通過改變原溶劑中的pH值，改變?nèi)苜|(zhì)的解離
3、 單級萃?。菏购苜|(zhì)的溶液（h）和萃取劑（L）解出混合，靜止后分成兩層。
4、 多級萃?。菏枪I(yè)生產(chǎn)最常用的萃取流程
分離效率高
產(chǎn)品回收率高
溶劑用量少
5、 常用的萃取設備
混合－沉降器
旋轉(zhuǎn)圓筒萃取塔
離心萃取器
填充塔
噴霧塔
旋轉(zhuǎn)圓盤塔
四、超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction， SFE）
1、超臨界流體：當一種流體處于其臨界點的溫度和壓力之下，則稱之為超臨界流體。
特點：
（a）密度接近液體－－萃取能力強
（b）粘度接近氣體－－傳質(zhì)性能好
2、超臨界流體萃取的基本思想
利用超臨界流體的特殊性質(zhì)，使其在超臨界狀態(tài)下，與待分離的物料接觸，萃取出目的產(chǎn)物，然后通過降壓或升溫的方法，使萃取物得到分離
常用萃取劑：
（1）極性萃取劑：乙醇、甲醇、水（難）
（2）非極性萃取劑：二氧化碳（易）
3、超臨界二氧化碳萃取
臨界點：
T：304.1 P：73.8 bar
優(yōu)點： 缺點：
臨界條件溫和 設備投資大
產(chǎn)品分離簡單
無毒、無害
不燃
無腐蝕性
價格便宜
超臨界CO2萃取流程圖
超臨界流體的應用
（1）咖啡因萃取
（2）植物油：胚芽油、玉米油、γ亞麻酸
（3）天然香料：杏仁油、檸檬油
（4）啤酒花
（5）尼古丁
五、雙水相萃?。ˋqueous Two Phase）
1、概念：利用物質(zhì)在不相溶的，兩水相間分配系數(shù)的差異進行萃取的方法
2、可以構(gòu)成雙水相的體系：
（1）離子型高聚物－非離子型高聚物
PEG－DEXTRAN
（2）高聚物－相對低分子量化合物
PEG－硫酸銨
3、雙水相萃取的原理
依據(jù)懸浮粒子與其周圍物質(zhì)具有的復雜的相互作用：
（a）氫鍵
（b）電荷力
（c）疏水作用
（d）范德華力
（e）構(gòu)象效應
4、雙水相系統(tǒng)中目標物分配系數(shù)的影響因素
（1）成相高聚物濃度－－界面張力
（2）成相高聚物的相對分子量
一般來說，蛋白等高分子量物質(zhì)易集中于低分子量相
（3）電化學分配
雙水相萃取時，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)受離子強度的影響很小
（4）疏水反應
（5）生物親和分配
（6）溫度及其它因素
5、雙水相萃取的優(yōu)點
（1）平衡時間短、含水量高、截面張力小，特別適合于生物活性物質(zhì)的分離純化
（2）操作簡便
（3）易于放大
六、反膠束萃取（Reversed Micelles Extraction）
膠束是表面活性劑在非極性有機溶劑中形成的一種聚集體
當表面活性劑濃度超過臨界微團濃度時，表面活性劑會在水溶液中形成聚集體
微團和反微團
1、微團：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”
2、反微團：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”
3、反微團的優(yōu)點
（1）極性“水核”具有較強的溶解能力。
（2）生物大分子由于具有較強的極性，可溶解于極性水核中，防止與外界有機溶劑接觸，減少變性作用。
（3）由于“水核”的尺度效應，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，增加其結(jié)構(gòu)的剛性，提高其反應性能。
因此，可作為酶固定化體系，用于水不溶性底物的生物催化
4、構(gòu)成反膠團的表面活性劑種類
（1）陰離子表面活性劑
AOT
（2）陽離子表面活性劑
季銨鹽
七、化學萃取
1、概念：利用可與被萃目標物發(fā)生反應的非極性物質(zhì)作為萃取劑進行的反應
2、絡合萃取分離有機酸（醋酸）
季銨鹽
叔胺
3、絡合萃取體系構(gòu)成
萃取劑
稀釋劑
八、本章作業(yè)
1、什么是萃取過程？
2、液－液萃取從機理上分析可分為哪兩類？
3、常見物理萃取體系由那些構(gòu)成要素？
4、何謂萃取的分配系數(shù)？其影響因素有哪些？
5、何謂超臨界流體萃取？其特點有哪些？
6、何謂雙水相萃取?常見的雙水相構(gòu)成體系有哪些？
7、反膠團的構(gòu)成以及反膠團萃取的基本原理
第六講 吸附與離子交換 6學時
一、通過本章學習應掌握的問題
1、什么是吸附過程？
2、吸附的類型有哪些？它們是如何劃分的？
3、常用的吸附劑種類有哪些？
4、什么是吸附等溫線？其意義何在？
5、影響吸附過程的因素有哪些？
6、什么是親和吸附？其特點有哪些？
7、常用的吸附單元操作有哪些方式？
8、什么是離子交換？
9、離子交換樹脂的分類？其主要的理化性質(zhì)有哪些？
10、離子交換的機理是什么？
11、什么是離子交換的選擇性？其選擇性受哪些因素影響？
12、基本的離子交換操作是怎樣的？
13、如何利用離子交換法分離蛋白質(zhì)？
二、什么是吸附？（Adsorption）
1、吸附是利用吸附劑對液體或氣體中某一組分具有選擇性吸附的能力，使其富集在吸附劑表面的過程。
2、吸附過程通常包括：待分離料液與吸附劑混合、吸附質(zhì)被吸附到吸附劑表面、料液流出、吸附質(zhì)解吸回收等四個過程。
三、常見的吸附類型及其主要特點
1、物理吸附： 吸附作用力為分子間引力、無選擇性、無需高活化能、吸附層可以是單層，也可以是多層、吸附和解吸附速度通常較快。
2、化學吸附：吸附作用力為化學鍵合力，需要高活化能、只能以單分子層吸附，選擇性強、吸附和解吸附速度較慢。
四、常用吸附劑種類
吸附劑通常應具備以下特征：對被分離的物質(zhì)具有較強的吸附能力、有較高的吸附選擇性、機械強度高、再生容易、性能穩(wěn)定、價格低廉。
1、活性炭：是非極性吸附劑，因此在水中吸附能力大于有機溶劑中的吸附能力
針對不同的物質(zhì)，活性炭的吸附規(guī)律遵循以下規(guī)律：
（1）對極性基團多的化合物的吸附力大于極性基團少的化合物
（2）對芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物;
（3）對相對分子量大的化合物的吸附力大于相對分子量小的化合物;
（4）pH值的影響 堿性 中性吸附 酸性洗脫;
酸性 中性吸附 堿性洗脫;
（5）溫度 未平衡前 隨溫度升高而增加;
2、大孔網(wǎng)狀吸附劑
特點：脫色去臭效果理想；對有機物具有良好的選擇性；物化性質(zhì)穩(wěn)定；機械強度好；吸附速度快；解吸、再生容易。
但價格昂貴，吸附效果易受流速以及溶質(zhì)濃度等因素的影響。
大孔網(wǎng)狀吸附樹脂的種類：
（1）非極性吸附樹脂：苯乙烯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑為二乙烯苯，又稱芳香族吸附劑。
（2）中等極性吸附樹脂：甲基丙烯酸酯交聯(lián)而成，交聯(lián)劑亦為甲基丙烯酸酯，故又稱脂肪族吸附劑。
（3）極性吸附劑：丙烯酰胺或亞砜經(jīng)聚合而成，通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基團。
吸附機理：
非離子型共聚物，借助于范德華力從溶液中吸附各種有機物，其吸附能力與樹脂的化學結(jié)構(gòu)、物理性能以及與溶質(zhì)、溶劑的性質(zhì)有關(guān)。通常遵循以下規(guī)律：
（1）非極性吸附劑可從極性溶劑中吸附非極性溶質(zhì)；
（2）極性吸附劑可從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)；
（3）中等極性吸附劑兼有以上兩種能力
四、吸附等溫線
概念：當溫度一定時，吸附量與濃度之間的函數(shù)關(guān)系稱為吸附等溫線。
Langmuir吸附等溫線
qo和K是經(jīng)驗常數(shù)，c代表溶液中溶質(zhì)濃度
蛋白質(zhì)分離提純時適合此吸附方程
五、影響吸附的主要因素
1、吸附劑的性質(zhì)：比表面積、粒度大小、極性…
2、吸附質(zhì)的性質(zhì)：對表面張力的影響，溶解度，極性，相對分子量…
3、溫度：吸附是放熱過程，吸附質(zhì)的穩(wěn)定性
4、溶液pH值：影響吸附質(zhì)的解離
5、鹽濃度：影響復雜，要視具體情況而定
六、親和吸附
1、親和吸附分離是利用溶質(zhì)和吸附劑之間特殊的化學作用，從而實現(xiàn)分離。
吸附劑由載體和配位體組成
2、親和吸附的特點
（a）效率高：利用親和吸附可以從粗提液中一次性分離得到高純度的活性物質(zhì)。
（b）分離精度高：可用于分離含量極低，結(jié)構(gòu)相近的化合物
（c）但通用性較差，洗脫條件苛刻
3、影響親和吸附的因素
（1）配基濃度 配基濃度高有利；
（2）空間位阻 加入“手臂鏈”以降低空間位阻的影響；
（3）配基與載體的結(jié)合位點 就蛋白質(zhì)等大分子作為配基時，與載體連接的鍵越少越好；
（4）載體孔徑：孔道大??；
（5）微環(huán)境：載體或“手臂鏈”的極性、電性；
七、離子交換(ion exchange)
1、概念：利用離子交換樹脂作為吸附劑，將溶液中的待分離組分，依據(jù)其電荷差異，依靠庫侖力吸附在樹脂上，然后利用合適的洗脫劑將吸附質(zhì)從樹脂上洗脫下來，達到分離的目的。
2、離子交換樹脂的構(gòu)成
（1）具有三維空間離體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡骨架
（2）聯(lián)接在骨架上的活性基團
（3）活性基團所帶的相反電荷的活性離子（可交換離子）
3、離子交換的分類
按活性基團分類，可分為陽離子交換樹脂(cation exchange)（含酸性基團）和陰離子交換樹脂(anion exchange)（含堿性基團）。
具體又可以分為：強陽、弱陽和強陰、弱陰
4、常用的離子交換樹脂
（1）強酸性陽離子交換樹脂：活性基團是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；
（2）弱酸性陽離子交換樹脂：活性基團有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基團；
（3）強堿性陰離子交換樹脂：活性基團為季銨基團，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基；
（4）弱堿性陰離子交換樹脂：活性基團為伯胺或仲胺，堿性較弱；
5、新型離子交換樹脂
（1）大孔離子交換樹脂
大孔離子交換樹脂具有和大孔吸附劑相同的骨架結(jié)構(gòu)，在大孔吸附劑合成后（加入致孔劑），再引入化學功能基團，便可得到大孔離子交換樹脂。
（2）多糖基離子交換樹脂
固相載體為多糖類物質(zhì)，親水性強、交換空間大、對生物大分子物致變性作用
主要的多糖基離子交換樹脂
（a）離子交換纖維素
樹脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團的性質(zhì)可分為陽離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類。
特點：骨架松散、親水性強、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高
常用的離子交換纖維素有：
甲基磺酸纖維素、羧甲基纖維素（CMC）、二乙基氨基乙基纖維素（DEAE）
（b）葡聚糖凝膠離子交換樹脂
骨架為葡聚糖凝膠，如sepharose、sephadex，根據(jù)功能基團的不同，亦可分為陽離子交換和陰離子交換樹脂
命名方法：交換活性基團+骨架+原骨架編號
特點：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率
常用的葡聚糖凝膠離子交換樹脂：
CM-sephadex C-25、DEAE-sephadex A-25等
6、離子交換樹脂的理化性能
（1）外觀：球形、淺色為宜，粒度大小為16~60目>90%；
（2）機械強度：>90%；
（3）含水量：0.3~0.7g/g 樹脂；
（4）交換容量：重量交換容量、體積交換容量、工作交換容量或稱表觀交換容量（在某一條件下）；
（5）穩(wěn)定性：化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性；
（6）膨脹度：交聯(lián)度、活性基團的性質(zhì)與數(shù)量、活性離子的性質(zhì)、介質(zhì)的性質(zhì)和濃度、骨架結(jié)構(gòu)；
（7）濕真密度：單位體積濕樹脂的重量；
（8）孔度、孔徑、比表面積
7、離子交換機理
8、影響交換速度的因素
（1）顆粒大?。河≡娇?/p>
（2）交聯(lián)度：交聯(lián)度小，交換速度快
（3）溫度：越高越快
（4）離子化合價：化合價與高，交換越快
（5）離子大?。涸叫≡娇?/p>
（6）攪拌速度：在一定程度上，越大越快
（7）溶液濃度：當交換速度為外擴散控制時，
濃度越大，交換速度越快
9、離子交換的選擇性
離子交換常數(shù)：交換勢或交換系數(shù)
10、影響離子交換選擇性的因素
（1）水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；
（2）離子化合價：高價離子易于被吸附；
（3）溶液pH：影響交換基團和交換離子的解離程度，但不影響交換容量；
（4）離子強度：越低越好；
（5）有機溶劑：不利于吸附；
（6）交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯(lián)度小，膨脹度大，吸附量減少；
（7）樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；
11、離子交換操作方法
（1） 樹脂預處理
物理處理：水洗、過篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹脂顆粒；
化學處理：轉(zhuǎn)型（氫型或鈉型）
陽離子樹脂 酸—堿—酸
陰離子樹脂 堿—酸—堿
最后以去離子水或緩沖液平衡
（2） 離子交換吸附
靜態(tài)：操作簡單、但是分批操作，交換不完全
動態(tài)：離子交換柱，操作連續(xù)、交換完全，適宜多組份分離
柱式固定床
（3） 洗脫
離子交換完成后，將樹脂吸附的物質(zhì)重新轉(zhuǎn)入溶液的方法
洗脫方法
（a）改變?nèi)芤簆H值
（b）改變?nèi)芤弘x子強度
（4）再生
是指是離子交換樹脂重新具有交換能力的過程
酸性陽離子樹脂 酸-堿-酸-緩沖溶液淋洗
堿性陰離子樹脂 堿-酸-堿-緩沖溶液淋洗
方式有：順流再生和逆流再生
八、離子交換應用實例（離子交換法提取蛋白質(zhì)）
1、 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點
（1） 多肽鏈
（2） 電荷分布不均勻
（3） 疏水性
（4） 不同的蛋白質(zhì)具有不同的表面電荷分布
2、 pH值對蛋白質(zhì)荷電情況的影響
3、 蛋白質(zhì)的滴定曲線
不同的蛋白質(zhì)由于其氨基酸組成的差異，具有不同的等電點（pI），當溶液（環(huán)境）pH值低于其pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，而當環(huán)境pH值高于其等電點時，蛋白質(zhì)帶負電荷，且偏離等電點越多，其所帶電荷越多；
4、 緩沖液pH的選擇
離子交換是依據(jù)不同蛋白質(zhì)荷電性質(zhì)以及大小差異進行分離的，因此緩沖液的選擇將直接影響蛋白質(zhì)的荷電情況，對于分離的選擇性具有重要影響。
5、 離子交換分離蛋白質(zhì)的基本步驟
蛋白質(zhì)的離子交換分離同樣要經(jīng)過：平衡、吸附、洗脫和再生四個階段，具體過程如下圖所示：
九、本章作業(yè)
1、P223 第一題，第二題
2、影響吸附的主要因素？
3、親和吸附的原理和特點是什么？
4、常用的離子交換樹脂類型有哪些？
5、影響離子交換速度的因素有哪些？
6、用于蛋白質(zhì)提取分離的離子交換劑有哪些哪些特殊要求，主要有哪幾類？
第七講 色譜技術(shù) 6學時
一、通過本章學習應掌握的問題
1、什么是色譜分離技術(shù)？
2、色譜分離技術(shù)的分類？
3、什么是色譜柱的理論塔板數(shù)以及如何計算理論塔板數(shù)？
4、什么是吸附色譜及其分類和基本原理？
5、什么是分配色譜？
6、離子交換色譜的分類及應用
7、凝膠色譜的分離原理及分類
8、離子交換及疏水作用層析的原理
9、高效液相色譜的分離原理及應用？
10、蛋白質(zhì)分離的常用色譜方法有哪些？
二、什么是色譜技術(shù)（Chromatography）
概念：色譜技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，色譜柱的一般結(jié)構(gòu)含有固定相（多孔介質(zhì)）和流動相，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達到分離的目的。
簡單的說，色譜技術(shù)是在特定的色譜柱當中，利用不同物質(zhì)與固定相的親和力差異而實現(xiàn)分離的一組技術(shù)。其優(yōu)點是分辨率高，是生化產(chǎn)品純化、分析的重要手段，這一切均源于其特殊的分離模式，即塔板理論
三、色譜分離方法的分類
色譜分離方法很多，種類有四、五十種。但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機理分，有以下幾種：
1、吸附色譜
2、分配色譜
3、離子交換色譜
4、凝膠色譜
四、色譜分離的基本概念
1、分配系數(shù)：可由Langmuir方程得出
Kd---分配系數(shù)
q、c---溶質(zhì)在固相和液相中的濃度
2、保留時間（tR）和保留體積（VR）：反應樣品在柱子中的保留或阻滯能力，是色譜過程的基本熱力學參數(shù)之一
3、色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度
反應不同時刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系
理論塔板數(shù)的計算方法：
N---理論塔板數(shù) tR---保留時間
W1/2---半峰寬 Wb---峰底寬度
理論塔板高度：
L---柱長
五、吸附色譜
1、原理：利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力(范德華力，包括色散力、誘導力、定向力以及氫鍵)的差異而實現(xiàn)分離
2、關(guān)鍵要素：吸附劑（固定相）和展開劑（流動相）的選擇
3、吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團，如-OH和-NH2
4、常用的吸附劑：
氧化鋁、硅膠、活性炭、纖維素、聚酰胺、硅藻土
5、展開劑的選擇
展開劑極性越大，對同一化合物的洗脫能力越大
因此，可以根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整展開劑的極性以獲得最佳的分離的效果
展開劑選擇的原則：
（1）對被分離組分應具有一定的解吸附能力，極性應比被分離物質(zhì)的極性略小
（2）展開劑應對被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力
6、吸附色譜的操作程序
（1）根據(jù)要分離組分的性質(zhì)（包括極性、分子量、分子結(jié)構(gòu)）選擇合適的固定相和流動相
（2）吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進行裝柱、平衡、上樣，測定穿透樣品含量以調(diào)整操作參數(shù)
（3）洗脫：采用有機溶劑洗滌、調(diào)節(jié)pH值以及體系離子強度，最大限度地回收目標產(chǎn)物
六、分配色譜
1、原理：利用溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法
2、構(gòu)成要素：固定相、載體、流動相
載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體
載體種類：
硅膠、硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠
固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相
流動相可以是極性的（反相色譜法），也可以是非極性的（正相色譜）
*反相色譜 固定相是非極性的流動相是極性的
3、HPLC（High Performance Liquid Chromatography）
是一種典型的分配色譜，它是基于化合物在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異而實現(xiàn)分離的，由于經(jīng)過了多次的吸附－解析－吸附的過程，其理論塔板數(shù)可高達數(shù)萬（分析性HPLC）
4、反相液相色譜
反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)使基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學性質(zhì)和流動相的選擇應最大限度地滿足疏水的要求
載體：微粒多孔硅膠（粒徑5μm~20μm ）
Hypersil Spherosil XOB075
固定相：C18、C8烷基鏈，C8適于分離蛋白質(zhì)
C18適于分離核酸
苯基
流動相的選擇
通常采用有機溶劑，乙腈、異丙醇、正丙醇和四氫呋喃
七、離子交換色譜
1、概念：以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法
2、常用的離子交換樹脂
（1）葡聚糖凝膠型
DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25
（2）纖維素系列離子交換劑
DEAE-Sephacel Cellex系列
（3）瓊脂糖系列離子交換劑
Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow
Bio-Gel A 系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑
（4）Source 系列離子交換劑
特點：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低
陽離子交換樹脂 S系列
陰離子交換樹脂 Q系列
（5）MonoBeads 系列離子交換劑（Pharmacia）
特點：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點，但動態(tài)載量更大，壽命更長。
同樣分為Q系列和P系列
八、分子篩凝膠色譜（Gel Penetration Chromatography, GPC）
1、概念：在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對分子量的組分得以分離
2、特點：
操作簡便
分離效果好，重復性高，回收率高
分離條件溫和
應用廣泛 適用于生物大分子的初級分離，脫鹽
分辨率低
3、分子篩凝膠色譜原理
不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過，保留時間短；而小分子恰恰相反，保留時間較長）而得以分離（如上圖所示）
九、疏水作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）
1、 原理：依據(jù)生物大分子疏水性差異實現(xiàn)分離
由于不同蛋白質(zhì)分子氨基酸組成差異，其疏水性也不盡相同，HIC技術(shù)是基于生物大分子的疏水性差異而實現(xiàn)分離的，該方法彌補了HPLC難以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離的不足。具體方法是：
在高鹽環(huán)境下，蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域暴露，固定相表面修飾了一些疏水的基團，這樣蛋白質(zhì)的疏水部分即可與固定相發(fā)生較強的疏水相互作用，從而被結(jié)合在固定相表面，而一旦降低流動相的鹽濃度即可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的洗脫（見下圖），方便易行，是蛋白質(zhì)分離的常用手段之一。
十、親和色譜（Affinity chromatography）
所謂親和色譜就是將親和技術(shù)和色譜技術(shù)集成得到的一種高效分離手段，其原理與親和吸附基本類似，所不同的是經(jīng)過修飾的載體顆粒是填充在色譜柱中，以實現(xiàn)連續(xù)的色譜分離
載體活化、配基連接、吸附、洗脫
十一、蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法
1、免疫親和層析
屬于吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強的吸附力，實現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)的分離
免疫親和層析介質(zhì)的獲得：
（1）獲得抗體
（2）抗體連接到載體上
2、疏水層析
在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團相互作用，從而實現(xiàn)多組分的分離。
3、離子交換色譜是最常用的蛋白質(zhì)分離手段
操作要點：
由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的pH值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定
由于蛋白質(zhì)的極性基團很多，為了避免洗脫困難，通常采用弱陽或弱陰離子交換劑
適當調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值，使蛋白質(zhì)適當解離，通常采用的pH值靠近其等電點（不是等電點）
緩沖溶液的離子強度不能過高，通常在10~20m mol
層析方案的確定，需要視試驗情況作適當調(diào)整
洗脫方式：pH梯度
離子強度梯度
十二、本章作業(yè)
1、色譜方法共分幾類？常用的蛋白質(zhì)分離方法有哪些？并簡述其原理
2、 何為理論塔板高度和理論塔板數(shù)？如何計算？
3、 簡述高效反相液相色譜的工作原理？
4、 試分析HPLC和HIC技術(shù)的異同
第八講 沉析 3學時
一、通過本章學習應掌握的問題
1、什么是沉析？
2、沉析法純化蛋白質(zhì)的優(yōu)點有哪些？
3、沉析的一般操作步驟是什么？
4、何謂鹽析？其原理是什么？
5、鹽析操作時常用的鹽是什么？
6、影響鹽析的主要因素有哪些？
7、有機溶劑沉析法的原理是什么？
8、影響有機溶劑沉析的主要因素有哪些？
9、等電點沉析的工作原理是什么？
10、其它常用的沉析方法有哪些？
二、何謂沉析？（Precipitation）
利用沉析劑（precipitator）使所需提取的生化物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。
三、沉析的特點
操作簡單、經(jīng)濟、濃縮倍數(shù)高，但針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強
四、分類
鹽析、有機溶劑沉析、等電點沉析等
五、沉析操作的一般過程
1、在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑；
2、沉淀物的陳化，促進晶體生長；
3、離心或過濾，收集沉淀物；
六、鹽析(Salt induced precipitation)
1、概念：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。
The most common type of precipitation for proteins is Salt induced precipitation. Protein solubility depends on several factors. It is observed that at low concentration of the salt, solubility of the proteins usually increases slightly. This is termed Salting in. But at high concentrations of salt, the solubility of the proteins drops sharply. This is termed Salting out and the proteins precipitate out.
2、鹽析原理
首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在狀態(tài)：
（1）兩性電解質(zhì)，由于靜電力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系
（2）蛋白質(zhì)周圍形成水化膜，保護了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞
3、鹽析過程
當中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：
（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大
（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降，原因如下：
（a）無機離子與蛋白質(zhì)表面電荷中和，形成離子對，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；
（b）中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導致沉淀；
4、離子強度對鹽析過程的影響
Cohn經(jīng)驗公式
S—蛋白質(zhì)溶解度，mol/L;
I—離子強度 c:離子濃度；Z：離子化合價
β—鹽濃度為0時，蛋白質(zhì)溶解度的對數(shù)值。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無關(guān)；
Ks—鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和無機鹽的種類有關(guān)，與溫度、pH值無關(guān)。
Ks鹽析法：在一定pH和溫度下，改變體系離子強度進行鹽析的方法；
β鹽析法：在一定離子強度下，改變pH和溫度進行鹽析；
其中，Ks鹽析法由于蛋白質(zhì)對離子強度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。
而β鹽析法由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。
5、鹽析用鹽的選擇
在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：
半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱
（Ks）磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂
選用鹽析用鹽的幾點考慮：
（1）鹽析作用要強
（2）鹽析用鹽需有較大的溶解度
（3）鹽析用鹽必須是惰性的
（4）來源豐富、經(jīng)濟
6、常用的鹽析用鹽
#硫酸銨：溶解度大（767g/L）
硫酸鈉
磷酸鹽
檸檬酸鹽
7、影響鹽析的因素
（1）溶質(zhì)種類的影響：Ks和β值
（2）溶質(zhì)濃度的影響：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；
（3）蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高；
（4）pH值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，通常調(diào)整體系pH值，使其在pI附近；
（5）鹽析溫度：大多數(shù)情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降；
8、鹽析用鹽的用量選擇
飽和度的概念：
以硫酸銨為例：
25oC時，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L，定義為100%飽和度
七、有機溶劑沉淀
1、概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。
2原理：
（1）降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致沉淀。
（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。
3、常用的有機溶劑沉析劑
乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；
丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；
特點：介電常數(shù)小，60%乙醇的介電常數(shù)是48
丙酮的介電常數(shù)是22
容易獲取
4、有機溶劑沉析的特點
（1）分辨率高；
（2）溶劑容易分離，并可回收使用；
（3）產(chǎn)品潔凈；
（4）容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；
（5）應注意在低溫下操作；
（6）成本高
5、溶劑選擇
（1）介電常數(shù)要小
（2）致變性作用要?。状迹?/p>
（3）毒性要小、揮發(fā)性適中
（4）水溶性要好
6、影響有機溶劑沉析的主要因素
（1）溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；
（2）攪拌速度：散熱
（3）溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。（pI）
（4）離子強度：離子強度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L
（5）樣品濃度：0.5~2%
?。喝軇┯昧看螅厥章实?，但共沉淀作用小
濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低
（6）金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+
八、等電點沉淀法
1、概念：
調(diào)節(jié)體系pH值，使兩性電解質(zhì)的溶解度下降，析出的操作稱為等電點沉淀。
2、原理：
蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結(jié)構(gòu)被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質(zhì)聚集體，進而產(chǎn)生沉淀。
3、特點：
由于在等電點附近，溶質(zhì)仍然有一定的溶解度，等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，因此等電點沉淀法通常與鹽析、有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用
操作時的注意事項：
（1）由于無機離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點通常會發(fā)生“漂移”，陽-高，陰-低
（2）溶質(zhì)的穩(wěn)定性
（3）鹽析效應
九、其它沉淀法
（1） 水溶性非離子型聚合物沉淀劑
PEG（聚乙二醇）、NPEO（壬苯乙烯化氧）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯
常用的此類沉淀劑是PEG，相對分子量一般為6000；
（2） 成鹽類復合物沉析劑
A. 金屬復合鹽：與生物分子的酸性基團作用，Cu2＋、Ag＋、Zn2＋
B. 有機酸復合鹽：與生物分子的堿性基團作用
C. 無機復合鹽：磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽
（3） 離子型表面活性劑
CTAB（十六烷基三甲基季銨鹽溴化物）、十二烷基磺酸鈉（SDS）
（4） 離子型多聚物沉析劑
核酸（多聚陰離子）、魚精蛋白（多聚陽離子）
（5） 氨基酸類沉析劑
一類選擇性沉淀劑。如組氨酸－氯化汞，精氨酸－苯甲醛，亮氨酸－鄰二甲基苯磺酸等
（6） 分離核酸用沉析劑
酚、氯仿、SDS
（7） 分離粘多糖用沉析劑
乙醇、CTAB
（8）選擇性變性沉析法
十、本章作業(yè)
（1）常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有哪些？
（2）影響鹽析的主要因素有哪些？
（3）何謂中性鹽的飽和度？鹽析操作中，中性鹽的用量（40% 硫酸銨飽和度）如何計算？
第九講 電泳與膜分離 6學時
一、 通過本章學習應掌握的內(nèi)容
1、 膜分離的概念
2、 膜的概念
3、 膜分離技術(shù)的分類
4、 基本的膜材料有哪些？
5、 常用的膜組件有哪些？
6、 何謂反滲透？實現(xiàn)反滲透分離的條件是什么？
7、 強制膜分離的概念？
8、 電滲析的工作原理？
9、 電泳的概念
10、 電泳的基本原理
11、 電泳技術(shù)的分類
12、 基本的電泳系統(tǒng)組成
13、 常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離原理
14、 SDS PAGE的分離原理
15、 何謂等電聚焦？如何形成載體兩性電解質(zhì)pH梯度？
16、 何謂雙相電泳？其作用是什么？
二、膜分離技術(shù)
1、 膜分離的概念
利用膜的選擇性（孔徑大?。?，以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推動力，由于溶液中各組分透過膜的遷移率不同而實現(xiàn)分離的一種技術(shù)。
2、 膜的概念
（1）在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱為膜。
（2）膜本身是均一的一相或由兩相以上凝聚物構(gòu)成的復合體
（3）被膜分開的流體相物質(zhì)是液體或氣體
（4）膜的厚度應在0.5mm以下，否則不能稱其為膜。
3、 膜分離技術(shù)的類型和定義
膜分離過程的實質(zhì)是物質(zhì)透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達到物質(zhì)分離的目的，故而可以按分離粒子大小進行分類：
（1）微濾：以多孔細小薄膜為過濾介質(zhì)，壓力為推動力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作，孔徑分布范圍在0.025~14μm之間；
（2）超濾：分離介質(zhì)同上，但孔徑更小，為0.001~0.02 μm，分離推動力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)；
（3）反滲透：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，孔徑范圍在0.0001~0.001 μm之間；（由于分離的溶劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而成為反滲透）；
（4）納濾：以壓力差為推動力，從溶液中分離300~1000小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均2nm；
（5）電滲析：以電位差為推動力，利用離子交換膜的選擇透過性，從溶液中脫除或富集電解質(zhì)的膜分離操作；
4、 膜的分類
u按孔徑大?。何V膜、超濾膜、反滲透膜、納濾膜
u按膜結(jié)構(gòu)：對稱性膜、不對稱膜、復合膜
u按材料分：合成有機聚合物膜、無機材料膜
5、 膜材料的特性
對于不同種類的膜都有一個基本要求：
（1）耐壓：膜孔徑小，要保持高通量就必須施加較高的壓力，一般模操作的壓力范圍在0.1~0.5Mpa，反滲透膜的壓力更高，約為1~10MPa
（2）耐高溫:高通量帶來的溫度升高和清洗的需要
（3）耐酸堿：防止分離過程中，以及清洗過程中的水解；
（4）化學相容性：保持膜的穩(wěn)定性；
（5）生物相容性：防止生物大分子的變性；
（6）成本低；
6、 各種膜材料
（1）有機高分子膜：
纖維素酯膜、縮合系聚合物（聚砜類）、聚烯烴及其共聚物、脂肪族或芳香族聚酰胺類聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯；
（2）無機多孔膜：陶瓷膜
7、 膜組件
（1）管式
（2）中空纖維
（3）螺旋卷繞式
（4）平板式
共同的特點
（1）盡可能大的膜表面積
（2）可靠的支撐裝置
（3）可引出透過液
（4）膜表面濃度差極化達到最小
8、超濾和反滲透
目的：將溶質(zhì)通過一層具有選擇性的薄膜，從溶液中分離出來
分離時的推動力都是壓強，由于被分離物質(zhì)的分子量和直徑大小差別及膜孔結(jié)構(gòu)不同，其采用的壓強大小不同。
反滲透膜的操作壓力高達10 MPa
超濾和反滲透操作中的滲透壓
由于超濾和反滲透過程都是用一種半透膜把兩種不同濃度的溶液隔開（淡水或鹽水），因此都存在滲透壓。
滲透壓的大小取決于溶液的種類、濃度和溫度；
一般說來，無機小分子的滲透壓要比有機大分子溶質(zhì)的滲透壓高得多。
9、滲透與反滲透
滲透是由于存在化學勢存在梯度而引起的自發(fā)擴散現(xiàn)象。
溶液中水的化學勢
因此，通常情況下，
其結(jié)果是水從純水一側(cè)透過半透膜向溶液側(cè)滲透，使后者的液位抬高。
如果在溶液一側(cè)施加壓力
，外界力做功使溶液中水的化學勢升高，則純水通過膜的滲透就會逐漸減小，并最終停止（條件？），此時的壓力差就是溶液的滲透壓
。
當
時，水將從溶液一側(cè)向純水一側(cè)移動，此種滲透稱之為反滲透。
10、實現(xiàn)超濾和反滲透的條件
u超濾：需要增加流體的靜壓力，改變天然過程的方向，才可能發(fā)生含有低分子量化合物的溶劑流通過膜，此時的推動力是流體靜壓力與滲透壓的壓差；
u反滲透：過程類似于超濾，只是純?nèi)軇┩ㄟ^膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作壓力比超濾大得多。
u因此，超濾和反滲透通常又被稱之為“強制膜分離過程”
11、超濾的基本方程
12、納米膜過濾技術(shù)
介于反滲透與超濾膜之間，能截留有機小分子而使大部分無機鹽通過；
特點：
（1）在過濾分離過程中，能截留小分子有機物，并可以同時透析除鹽，集濃縮與透析為一體；
（2）操作壓力低
13、電滲析技術(shù)
電滲析技術(shù)是在直流電場的作用下，由于離子交換膜的阻隔作用，實現(xiàn)溶液的淡化和濃縮，分離推動力是靜電引力。
三、電泳技術(shù)
1、電泳概念
Arne Tiselius——物理化學家、諾貝爾獎金獲得者
定義——荷電的膠體粒子在電場中的移動；
電泳決定于環(huán)繞每個離子的離子霧中的擴散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強度越高時，電泳現(xiàn)象變得越明顯。因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢和雙電層的因素起著決定性的作用。
2、電泳的原理
蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其它大分子的相互作用。
帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學與化學特性。
3、電泳遷移率
電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。
其單位是cm2·sec-1 ·V-1
電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不同物質(zhì)的基礎(chǔ)
4、電泳的大致分類
依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng)
（1）移動界面電泳（moving boundary electrophoresis）
（2）區(qū)帶電泳（zone electrophoresis ）
（3）穩(wěn)態(tài)電泳（steady state electrophoresis ）
其中以區(qū)帶電泳為目前常用的電泳系統(tǒng)。
5、區(qū)帶電泳的主要技術(shù)
具有支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳具有防止電泳過程中的對流和擴散，可使被分離的成分得到最大分辨率的分離；
區(qū)帶電泳中的常用技術(shù)
載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳
無載體電泳：自由電泳、毛細管電泳
6、凝膠電泳
作為電泳支持介質(zhì)必須具有：化學惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學穩(wěn)定性好、均勻、重復性好、電內(nèi)滲小等特性。
凝膠電泳的支持介質(zhì)：
（1）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, PGA）
由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成；
（2）瓊脂糖凝膠：
從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結(jié)構(gòu)大部分是由1，3連接的β-D吡喃半乳糖和1，4連接的3，6脫水α-D吡喃半乳糖交替形成的；
8、 丙烯酰胺的聚合
烯酰胺的聚合通常是由化學或光化學過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來引發(fā)該過程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。
該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實質(zhì)是自由基催化的氧化-還原過程。
丙烯酰胺的化學聚合是由過硫酸銨在堿性條件下，產(chǎn)生游離氧自由基引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基狀態(tài)，經(jīng)過一系列的自由基反應得到的聚合物；
9、 影響聚合的主要因素
（1）引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導致聚合速度慢；濃度過大則易導致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在40~60分鐘內(nèi)完成。
（2）系統(tǒng)pH值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳pH值，以獲得最佳的聚合結(jié)果；
（3）溫度：低溫下聚合導致凝膠變脆和混濁；適當提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；
（4）分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合；抽氣
（5）系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；
10、聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應
在使用凝膠介質(zhì)的電泳中，由于電泳介質(zhì)具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴散減到最小。
凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀
凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（size sieving capacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應（molecular sieving effect）
11、瓊脂糖凝膠的性能、結(jié)構(gòu)與特點
（1）瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較凝膠電泳低。
（2）機械強度高：可以在濃度1%以下使用；
（3）無毒；
（4）染色、脫色程序簡單，背景色較低；
（5）熱可逆性；
（6）生物中性：一般不與生物材料結(jié)合；
（7）電內(nèi)滲（EEO）大：對于對流電泳有益
12、電泳系統(tǒng)的基本組成
（1）電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽
（2）電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200~600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳1000~2000V，固相梯度等電聚焦3000~8000V
（3）外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會產(chǎn)生高熱，需冷卻；
（4）凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥；
（5）灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；
（6）電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如PVDF膜
（7）電泳洗脫儀：回收樣品
（8）凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進行掃描，從而給出定量的結(jié)果。
13、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳
（1）原理
由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級，能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應。
因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離時，在電泳過程中不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。
PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳
（2）電泳前的準備工作
緩沖系統(tǒng)的選擇：
（a）保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持；
（b）電泳時間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應限制在3~10之間。
緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標準的對立權(quán)衡
（a）如果緩沖液的pH選擇在遠離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細而窄；
（b）如果緩沖pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高；
因此，常常選擇pH 8.0~9.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH 8.3~9.5），Tris-硼酸(pH 8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH 7.2~8.5）
凝膠濃度的選擇
由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且取決于分子的大小、形狀。因此，凝膠的分子篩效應（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關(guān)。
根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為：
（a）非排阻性凝膠（unrestrictive gel）:濃度0.7 ~1.0%的瓊脂糖凝膠；
（b）排阻性凝膠（restrictive gel）：濃度大于1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī)PAGE
凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置；
凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進，不能得到很好的分離；
PAGE的具體操作過程
制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠；
樣品準備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（1~2mg/L，考染），加樣（溴酚藍）；
電泳：4~6小時，待溴酚藍前沿到達陽極底部；
檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍R-250、銀染色—靈敏度比考染高100倍、熒光探針）；
照相、凝膠干燥；
定量測定；
14、SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳
十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
主要用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的測定；
特點：設備簡單、操作簡便、測定快速、重復性高、樣品無需純化。
（1）SDS-PAGE 的原理
蛋白質(zhì)分子的解聚
SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)；而強還原劑，如二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。
因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合后，形成帶負電的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質(zhì)-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。
（2）未知蛋白質(zhì)分子量的測定
基于上述SDS-PAGE的原理介紹，我們可以利用SDS-PAGE電泳進行未知蛋白質(zhì)的分子量測定；
以不同分子量的標準蛋白進行SDS-PAGE電泳得到不同標準蛋白的電泳遷移率，制作標準校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進行SDS-PAGE電泳，測定遷移率，從標準曲線得到相應的分子量；
15、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦
等電聚焦（isoelectrofocusing）, IEF
利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析。
利用等電聚焦技術(shù)分離、分析的對象僅限于蛋白質(zhì)和兩性分子。
根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質(zhì)梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。
（1）工作原理
蛋白質(zhì)的等電點
蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，它們在不同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負電，只是在某一pH時，蛋白質(zhì)的凈電荷為0，此pH即為該蛋白的等電點（isoelectric point pI）。
蛋白質(zhì)的等電點取決于它的氨基酸組成和構(gòu)象，是一個物理化學常數(shù)。
可以利用等電點差異來進行蛋白質(zhì)的分離、分析
（2）載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦原理
載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦就是在支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在兩極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，當帶電的蛋白質(zhì)分子進入該體系時，便會產(chǎn)生移動，并聚集于相當于其等電點的位置。
載體兩性電解質(zhì)和pH梯度的形成
等電聚焦技術(shù)的關(guān)鍵在于pH梯度的建立
載體兩性電解質(zhì)的概念：
作為載體兩性電解質(zhì)應該具有以下特點：
（a）應該是兩性的，使它們在分離柱中也能達到一個平衡位置；
（b）應該可以作為“載體”，兩性電解質(zhì)不能用于等電聚焦，只有載體兩性電解質(zhì)，即具有好的導電性和好的緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。
用于等電聚焦的主要載體兩性電解質(zhì)
Ampholine(瑞典LKB公司)
由許多脂肪族的多氨基多羧基的異構(gòu)體和同系物組成，它們具有連續(xù)改變的氨基與羧基比
pH梯度的形成
在沒有電場時，載體兩性電解質(zhì)的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值，所有載體兩性電解質(zhì)分子都荷電。
當引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點的分子（荷最多負電）將最快地向陽極移動；當它達到凈電荷為0的位置時才停止，這個位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。
其次，一些低pI的載體兩性電解質(zhì)（荷其次多的負電）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到0才停止。同樣的，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。依次類推，所有的載體兩性電解質(zhì)分子用增加pI級數(shù)的方法將分別在陽極、陰極之間到達它們自己的位置，從而給出一個pH梯度。
水平等電聚焦電泳
制膠：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、載體兩性電解質(zhì)等），灌膠；
電泳：加樣可在凝膠上的任何位置，濃度一般為0.5~2mg/ml；
固定：
染色：
脫色：
（3）等電聚焦的主要應用
同工酶分離、分析
pI 測定
16、雙相電泳
第一相 等電聚焦
第二相 SDS－PAGE
目的：為了獲得更詳細的組分信息。目前已經(jīng)廣泛應用于蛋白質(zhì)組研究中
四、本章作業(yè)
1、 何謂膜分離？
2、 膜分離的種類
3、 何謂反滲透？
4、 常用的膜分離組件有哪些？
5、 何謂電泳？
6、 常規(guī)PAGE和SDS PAGE電泳有何異同？
7、 何謂雙相電泳？
第十講 結(jié)晶 3學時
一、通過本章學習應掌握的內(nèi)容
（1）什么是結(jié)晶過程？
（2）結(jié)晶操作的特點有哪些？
（3）凱爾文公式的內(nèi)容？
（4）了解飽和溫度曲線和過飽和溫度曲線的內(nèi)容？
（5）在何種條件下，溶液中才有晶體析出？
（6）影響晶體形成的主要因素有哪些？
（7）晶種的作用是什么？
（8）過飽和溶液形成的方法有哪些？
（9）何為晶體生長的擴散學說？其具體意義何在？
（10）常用的工業(yè)起晶方法有哪些？
（11）晶體純度的計算方法？
（12）影響晶體質(zhì)量的因素有哪些？
（13）何為重結(jié)晶？
二、結(jié)晶的概念（Crystalization）
溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學成分均一，具有各種對稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點上呈規(guī)則的排列
固體有結(jié)晶和無定形兩種狀態(tài)
結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時間進行排列，粒子排列有規(guī)則
無定形固體：析出速度快，粒子排列無規(guī)則
三、結(jié)晶操作的特點
（1）只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。
（2）通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。
（3）結(jié)晶過程具有成本低、設備簡單、操作方便，廣泛應用于氨基酸、有機酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。
四、結(jié)晶過程分析
飽和溶液：當溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；
過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；
溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出；
溶質(zhì)溶解度與溫度、溶質(zhì)分散度（晶體大?。┯嘘P(guān)。
五、凱爾文（Kelvin）公式
六、結(jié)晶過程的實質(zhì)
（1）結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程。
（2）這一過程不僅包括溶質(zhì)分子凝聚成固體，還包括這些分子有規(guī)律地排列在一定晶格中，這一過程與表面分子化學鍵力變化有關(guān)；
因此，結(jié)晶過程是一個表面化學反應過程。
七、晶體的形成
形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達到飽和溶解度時，晶體尚不能析出，只有當溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度后，才可能有晶體析出。
首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有較大的溶解度。實質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成—溶解—再形成的動態(tài)平衡之中，只有達到一定的過飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在
八、結(jié)晶的步驟
（1）過飽和溶液的形成
（2）晶核的形成
（2）晶體生長
其中，溶液達到過飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過飽和度是結(jié)晶的推動力。
九、溫度與溶解度的關(guān)系
由于物質(zhì)在溶解時要吸收熱量、結(jié)晶時要放出結(jié)晶熱。因此，結(jié)晶也是一個質(zhì)量與能量的傳遞過程，它與體系溫度的關(guān)系十分密切。
溶解度與溫度的關(guān)系可以用飽和曲線和過飽和曲線表示
在溫度-溶解度關(guān)系圖中，SS曲線下方為穩(wěn)定區(qū)，在該區(qū)域任意一點溶液均是穩(wěn)定的；
而在SS曲線和TT曲線之間的區(qū)域為亞穩(wěn)定區(qū)，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可長時間保持穩(wěn)定；
加入晶核后，溶質(zhì)在晶核周圍聚集、排列，溶質(zhì)濃度降低，并降至SS線；
介于飽和溶解度曲線和過飽和溶解度曲線之間的區(qū)域，可以進一步劃分刺激結(jié)晶區(qū)和養(yǎng)晶區(qū)。
在TT曲線的上半部的區(qū)域稱為不穩(wěn)定區(qū)，在該區(qū)域任意一點溶液均能自發(fā)形成結(jié)晶，溶液中溶質(zhì)濃度迅速降低至SS線（飽和）；
晶體生長速度快，晶體尚未長大，溶質(zhì)濃度便降至飽和溶解度，此時已形成大量的細小結(jié)晶，晶體質(zhì)量差；
因此，工業(yè)生產(chǎn)中通常采用加入晶種，并將溶質(zhì)濃度控制在養(yǎng)晶區(qū)，以利于大而整齊的晶體形成。
十、過飽和溶液的形成
（1）熱飽和溶液冷卻（等溶劑結(jié)晶）
適用于溶解度隨溫度升高而增加的體系；同時，溶解度隨溫度變化的幅度要適中；
（2）部分溶劑蒸發(fā)法（等溫結(jié)晶法）
適用于溶解度隨溫度降低變化不大的體系，或隨溫度升高溶解度降低的體系；
（3）真空蒸發(fā)冷卻法
使溶劑在真空下迅速蒸發(fā)，并結(jié)合絕熱冷卻，是結(jié)合冷卻和部分溶劑蒸發(fā)兩種方法的一種結(jié)晶方法。
（4）化學反應結(jié)晶
加入反應劑產(chǎn)生新物質(zhì)，當該新物質(zhì)的溶解度超過飽和溶解度時，即有晶體析出；
十一、晶核的形成
晶核的形成是一個新相產(chǎn)生的過程，需要消耗一定的能量才能形成固液界面；
結(jié)晶過程中，體系總的自由能變化分為兩部分，即：表面過剩吉布斯自由能（ΔGs）和體積過剩吉布斯自由能（ΔGv）
晶核的形成必須滿足：
ΔG= ΔGs+ ΔGv<0
通常ΔGs>0，阻礙晶核形成； ΔGv<0
十二、成核速度
由Arrhenius公式可近似得到成核速度公式：
B = ke-?Gmax/RT
B——成核速度
?Gmax——成核時臨界吉布斯自由能，是成核時必須逾越的能閾
k——常數(shù)
而?Gmax可由下式表示：
十三、常用的工業(yè)起晶方法
（1）自然起晶法：溶劑蒸發(fā)進入不穩(wěn)定區(qū)形成晶核、當產(chǎn)生一定量的晶種后，加入稀溶液使溶液濃度降至亞穩(wěn)定區(qū)，新的晶種不再產(chǎn)生，溶質(zhì)在晶種表面生長。
（2）刺激起晶法：將溶液蒸發(fā)至亞穩(wěn)定區(qū)后，冷卻，進入不穩(wěn)定區(qū)，形成一定量的晶核，此時溶液的濃度會有所降低，進入并穩(wěn)定在亞穩(wěn)定的養(yǎng)晶區(qū)使晶體生長。
（3）晶種起晶法：將溶液蒸發(fā)后冷卻至亞穩(wěn)定區(qū)的較低濃度，加入一定量和一定大小的晶種，使溶質(zhì)在晶種表面生長。
十四、晶體的生長
在過飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過飽和度為推動力，晶核或晶種將長大，這種現(xiàn)象稱為晶體生長。
晶體生長的擴散學說：
根據(jù)晶體擴散學說，晶體的生長由三個步驟組成：
（1） 結(jié)晶溶質(zhì)借擴散作用穿過靠近晶體表面的一個滯流層，從溶液中轉(zhuǎn)移到晶體的表面；
擴散過程的速度是取決于液相主體濃度與晶體表面濃度之差；
kd——擴散傳質(zhì)系數(shù)
A——晶體表面積
C——液相主體濃度
Ci——溶液界面濃度
（2） 到達晶體表面的溶質(zhì)長入晶面，同時放出結(jié)晶熱；
這是一個表面反應過程，其速度取決于晶體表面濃度與飽和濃度之差；
kr——表面反應速率常數(shù)
A——晶體表面積
C×——溶液飽和濃度
Ci——溶液界面濃度
聯(lián)立上述二式可得下式：
，其中
為總的傳質(zhì)推動力，即過飽和度；
為總傳質(zhì)系數(shù)
則有：
（3） 放出的結(jié)晶熱傳遞回到溶液中
十五、影響晶體生長速度的因素
（1）雜質(zhì)：改變晶體和溶液之間界面的滯留層特性，影響溶質(zhì)長入晶體、改變晶體外形、因雜質(zhì)吸附導致的晶體生長緩慢；
（2）攪拌：加速晶體生長、加速晶核的生成；
（3）溫度：促進表面化學反應速度的提高，增加結(jié)晶速度；
十六、提高晶體質(zhì)量的方法
（1）晶體質(zhì)量包括三個方面的內(nèi)容：
晶體大小
形狀
純度
（2）影響晶體大小的因素：
溫度、晶核質(zhì)量、攪拌等
（3）影響晶體形狀的因素：
改變過飽和度、改變?nèi)軇w系、雜質(zhì)
（4）影響晶體純度的因素：
母液中的雜質(zhì)、結(jié)晶速度、晶體粒度及粒度分布
十七、重結(jié)晶
經(jīng)過一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會含有一定量的雜質(zhì)。此時工業(yè)上常常需要采用重結(jié)晶的方式進行精制。
重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度下的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑再次結(jié)晶，以獲得高純度的晶體的操作。
重結(jié)晶的操作過程
（1）選擇合適的溶劑；
（2）將經(jīng)過粗結(jié)晶的物質(zhì)加入少量的熱溶劑中，并使之溶解；
（3）冷卻使之再次結(jié)晶；
（4）分離母液；
（5）洗滌；
十八、本章作業(yè)
1、結(jié)晶操作的原理是什么？
2、繪制飽和溫度曲線和過飽和溫度曲線，并標明穩(wěn)定區(qū)、亞穩(wěn)定區(qū)和不穩(wěn)定區(qū)。
第十講 結(jié)晶 3學時
一、通過本章學習應掌握的內(nèi)容
（1）什么是結(jié)晶過程？
（2）結(jié)晶操作的特點有哪些？
（3）凱爾文公式的內(nèi)容？
（4）了解飽和溫度曲線和過飽和溫度曲線的內(nèi)容？
（5）在何種條件下，溶液中才有晶體析出？
（6）影響晶體形成的主要因素有哪些？
（7）晶種的作用是什么？
（8）過飽和溶液形成的方法有哪些？
（9）何為晶體生長的擴散學說？其具體意義何在？
（10）常用的工業(yè)起晶方法有哪些？
（11）晶體純度的計算方法？
（12）影響晶體質(zhì)量的因素有哪些？
（13）何為重結(jié)晶？
二、結(jié)晶的概念（Crystalization）
溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學成分均一，具有各種對稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點上呈規(guī)則的排列
固體有結(jié)晶和無定形兩種狀態(tài)
結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時間進行排列，粒子排列有規(guī)則
無定形固體：析出速度快，粒子排列無規(guī)則
三、結(jié)晶操作的特點
（1）只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。
（2）通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。
（3）結(jié)晶過程具有成本低、設備簡單、操作方便，廣泛應用于氨基酸、有機酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。
四、結(jié)晶過程分析
飽和溶液：當溶液中溶質(zhì)濃度等于該溶質(zhì)在同等條件下的飽和溶解度時，該溶液稱為飽和溶液；
過飽和溶液：溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度時，該溶液稱之為過飽和溶液；
溶質(zhì)只有在過飽和溶液中才能析出；
溶質(zhì)溶解度與溫度、溶質(zhì)分散度（晶體大小）有關(guān)。
五、凱爾文（Kelvin）公式
六、結(jié)晶過程的實質(zhì)
（1）結(jié)晶是指溶質(zhì)自動從過飽和溶液中析出，形成新相的過程。
（2）這一過程不僅包括溶質(zhì)分子凝聚成固體，還包括這些分子有規(guī)律地排列在一定晶格中，這一過程與表面分子化學鍵力變化有關(guān)；
因此，結(jié)晶過程是一個表面化學反應過程。
七、晶體的形成
形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達到飽和溶解度時，晶體尚不能析出，只有當溶質(zhì)濃度超過飽和溶解度后，才可能有晶體析出。
首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有較大的溶解度。實質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成—溶解—再形成的動態(tài)平衡之中，只有達到一定的過飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在
八、結(jié)晶的步驟
（1）過飽和溶液的形成
（2）晶核的形成
（2）晶體生長
其中，溶液達到過飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過飽和度是結(jié)晶的推動力。
九、溫度與溶解度的關(guān)系
由于物質(zhì)在溶解時要吸收熱量、結(jié)晶時要放出結(jié)晶熱。因此，結(jié)晶也是一個質(zhì)量與能量的傳遞過程，它與體系溫度的關(guān)系十分密切。
溶解度與溫度的關(guān)系可以用飽和曲線和過飽和曲線表示
在溫度-溶解度關(guān)系圖中，SS曲線下方為穩(wěn)定區(qū)，在該區(qū)域任意一點溶液均是穩(wěn)定的；
而在SS曲線和TT曲線之間的區(qū)域為亞穩(wěn)定區(qū)，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可長時間保持穩(wěn)定；
加入晶核后，溶質(zhì)在晶核周圍聚集、排列，溶質(zhì)濃度降低，并降至SS線；
介于飽和溶解度曲線和過飽和溶解度曲線之間的區(qū)域，可以進一步劃分刺激結(jié)晶區(qū)和養(yǎng)晶區(qū)。
在TT曲線的上半部的區(qū)域稱為不穩(wěn)定區(qū)，在該區(qū)域任意一點溶液均能自發(fā)形成結(jié)晶，溶液中溶質(zhì)濃度迅速降低至SS線（飽和）；
晶體生長速度快，晶體尚未長大，溶質(zhì)濃度便降至飽和溶解度，此時已形成大量的細小結(jié)晶，晶體質(zhì)量差；
因此，工業(yè)生產(chǎn)中通常采用加入晶種，并將溶質(zhì)濃度控制在養(yǎng)晶區(qū)，以利于大而整齊的晶體形成。
十、過飽和溶液的形成
（1）熱飽和溶液冷卻（等溶劑結(jié)晶）
適用于溶解度隨溫度升高而增加的體系；同時，溶解度隨溫度變化的幅度要適中；
（2）部分溶劑蒸發(fā)法（等溫結(jié)晶法）
適用于溶解度隨溫度降低變化不大的體系，或隨溫度升高溶解度降低的體系；
（3）真空蒸發(fā)冷卻法
使溶劑在真空下迅速蒸發(fā)，并結(jié)合絕熱冷卻，是結(jié)合冷卻和部分溶劑蒸發(fā)兩種方法的一種結(jié)晶方法。
（4）化學反應結(jié)晶
加入反應劑產(chǎn)生新物質(zhì)，當該新物質(zhì)的溶解度超過飽和溶解度時，即有晶體析出；
十一、晶核的形成
晶核的形成是一個新相產(chǎn)生的過程，需要消耗一定的能量才能形成固液界面；
結(jié)晶過程中，體系總的自由能變化分為兩部分，即：表面過剩吉布斯自由能（ΔGs）和體積過剩吉布斯自由能（ΔGv）
晶核的形成必須滿足：
ΔG= ΔGs+ ΔGv<0
通常ΔGs>0，阻礙晶核形成； ΔGv<0
十二、成核速度
由Arrhenius公式可近似得到成核速度公式：
B = ke-?Gmax/RT
B——成核速度
?Gmax——成核時臨界吉布斯自由能，是成核時必須逾越的能閾
k——常數(shù)
而?Gmax可由下式表示：
十三、常用的工業(yè)起晶方法
（1）自然起晶法：溶劑蒸發(fā)進入不穩(wěn)定區(qū)形成晶核、當產(chǎn)生一定量的晶種后，加入稀溶液使溶液濃度降至亞穩(wěn)定區(qū)，新的晶種不再產(chǎn)生，溶質(zhì)在晶種表面生長。
（2）刺激起晶法：將溶液蒸發(fā)至亞穩(wěn)定區(qū)后，冷卻，進入不穩(wěn)定區(qū)，形成一定量的晶核，此時溶液的濃度會有所降低，進入并穩(wěn)定在亞穩(wěn)定的養(yǎng)晶區(qū)使晶體生長。
（3）晶種起晶法：將溶液蒸發(fā)后冷卻至亞穩(wěn)定區(qū)的較低濃度，加入一定量和一定大小的晶種，使溶質(zhì)在晶種表面生長。
十四、晶體的生長
在過飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過飽和度為推動力，晶核或晶種將長大，這種現(xiàn)象稱為晶體生長。
晶體生長的擴散學說：
根據(jù)晶體擴散學說，晶體的生長由三個步驟組成：
（4） 結(jié)晶溶質(zhì)借擴散作用穿過靠近晶體表面的一個滯流層，從溶液中轉(zhuǎn)移到晶體的表面；
擴散過程的速度是取決于液相主體濃度與晶體表面濃度之差；
kd——擴散傳質(zhì)系數(shù)
A——晶體表面積
C——液相主體濃度
Ci——溶液界面濃度
（5） 到達晶體表面的溶質(zhì)長入晶面，同時放出結(jié)晶熱；
這是一個表面反應過程，其速度取決于晶體表面濃度與飽和濃度之差；
kr——表面反應速率常數(shù)
A——晶體表面積
C×——溶液飽和濃度
Ci——溶液界面濃度
聯(lián)立上述二式可得下式：
，其中
為總的傳質(zhì)推動力，即過飽和度；
為總傳質(zhì)系數(shù)
則有：
（6） 放出的結(jié)晶熱傳遞回到溶液中
十五、影響晶體生長速度的因素
（1）雜質(zhì)：改變晶體和溶液之間界面的滯留層特性，影響溶質(zhì)長入晶體、改變晶體外形、因雜質(zhì)吸附導致的晶體生長緩慢；
（2）攪拌：加速晶體生長、加速晶核的生成；
（3）溫度：促進表面化學反應速度的提高，增加結(jié)晶速度；
十六、提高晶體質(zhì)量的方法
（1）晶體質(zhì)量包括三個方面的內(nèi)容：
晶體大小
形狀
純度
（2）影響晶體大小的因素：
溫度、晶核質(zhì)量、攪拌等
（3）影響晶體形狀的因素：
改變過飽和度、改變?nèi)軇w系、雜質(zhì)
（4）影響晶體純度的因素：
母液中的雜質(zhì)、結(jié)晶速度、晶體粒度及粒度分布
十七、重結(jié)晶
經(jīng)過一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會含有一定量的雜質(zhì)。此時工業(yè)上常常需要采用重結(jié)晶的方式進行精制。
重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度下的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑再次結(jié)晶，以獲得高純度的晶體的操作。
重結(jié)晶的操作過程
（1）選擇合適的溶劑；
（2）將經(jīng)過粗結(jié)晶的物質(zhì)加入少量的熱溶劑中，并使之溶解；
（3）冷卻使之再次結(jié)晶；
（4）分離母液；
（5）洗滌；
十八、本章作業(yè)
